Высокая пропускная способность идентификации бактерий репелленты Полимеры для медицинских приборов

Общая цель этого метода полимерных микрочипов заключается в идентификации синтетических полимеров, способных модулировать прикрепление бактерий к абиотическим поверхностям. Этот метод может помочь ускорить прогресс в открытии простых, экономически эффективных биоматериалов, которые подавляют прикрепление бактерий к медицинским устройствам. Основным преимуществом этого метода по сравнению с традиционными исследованиями биоматериалов при тестировании одного материала за раз является его способность одновременно проводить скрининг сотен полимеров в одном активе.

Для начала приготовьте полимерные растворы и добавьте их в лунки 384-луночной пластины, согласно текстовому протоколу. Создайте процедуру печати полимеров в четырех точках, состоящих из 1536 пятен, расположенных в виде 48 строк и 32 столбцов, печатая 32 полимерных раствора за один раз, чтобы принтер можно было остановить после печати каждой секции для очистки контактов. Теперь поместите горки с агарозным покрытием на платформу и обеспечьте хорошее вакуумное уплотнение, чтобы удерживать горки на месте.

Чтобы отрегулировать печатающую головку так, чтобы все контакты находились на одинаковой высоте, вручную опустите головку на предметное стекло и убедитесь, что контакты одновременно движутся вверх. Поместите пластину лунки на держатель пластины с лункой A1 в правом верхнем углу держателя и убедитесь, что пластина лунки надежно закреплена. Убедитесь, что ползунок и пластина лунки находятся на месте при появлении запроса.

Печатайте по одной секции за раз, что позволяет очищать контакты между секциями. Затем с помощью бумажного полотенца, смоченного в ацетоне, тщательно очистите булавки. Затем нанесите сухую папиросную бумагу, чтобы булавки полностью высохли.

Когда микрочипы будут полностью напечатаны, поместите их в держатель слайдов и перенесите в вакуумную печь, установленную при температуре 40 градусов Цельсия для сушки, чтобы удалить N&P в полимерных пятнах. Затем с помощью ультрафиолетового света стерилизуйте пластины в течение 30 минут. Перед тем, как закинуть предметные стекла бактериями, проведите замер фоновой флуоресценции согласно текстовому протоколу.

После культивирования и подготовки инокуляции для микрочипов, в соответствии с текстовым протоколом, поместите стерилизованные ультрафиолетовым излучением полимерные микрочипы в прямоугольные четырехлуночные планшеты и добавьте шесть миллилитров смешанных бактериальных культур. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия при слабом помешивании в течение пяти дней. После инкубации используйте PBS, чтобы дважды аккуратно промыть микрочипы.

Затем добавьте один микрограмм на миллилитр DAPI в PBS и выдерживайте в течение 30 минут. Затем перенесите микрочипы в свежий четырехлуночный планшет, накройте микрочипы PBS и аккуратно взболтайте. Затем измените PBS один раз и повторите стирку.

После промывки высушите микрочипы под воздействием воздуха, затем наклейте герметизирующую пленку и прикрепите стеклянные защитные стекла к предметным стеклам микрочипов. Когда клей высохнет, используйте 70% этанол для стерилизации внешней поверхности. С помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 20-кратным субъективным объективом, можно получить отдельные изображения для каждого полимерного пятна в ярком поле и полосчатых каналах.

Для покрытия покровных листов полимерами готовят растворы полимеров ХИТ в тетрагидрофуране или другом подходящем растворителе. С помощью прядильной установки в течение десяти секунд наносите полимерные растворы на круглые стеклянные покровные изделия подходящего размера со скоростью 2000 об/мин. Сушите покрытые чехлом в аэрогриле при температуре 40 градусов Цельсия в течение ночи.

И используйте ультрафиолетовый свет, чтобы стерилизовать покровные стекла в течение 30 минут перед инокуляцией бактериями. Поместите стерилизованные УФ-фильтрами крышки в стандартную 12- или 24-луночную пластину и инкубируйте с бактериями, как было показано ранее в этом видео. После инкубации используйте 0,1 молярного какодилатного буфера, чтобы дважды промыть покрытые покровные стекла, а затем с 2,5% веса на объем глутаральдегида и 0,1 молярного какодилатного буфера, зафиксируйте образцы в течение двух часов.

После фиксации крышки скользит 1%-ным тетраоксидом осмия на один час при комнатной температуре. Перед обезвоживанием их в этаноловый ряд в течение 30 минут при каждой концентрации. Затем с помощью распылительной установки для нанесения покрытий и смеси золота и платинового сплава от 60 до 40% нанесите на образцы ток 30 миллиампер и вакуум 0,75 мм рт. ст.

После получения изображений с помощью SEM визуально сравните изображения непокрытых покровных стекол и тех, которые покрыты агарозой или полимерами HIT, чтобы подтвердить бактериальные связывающие или отталкивающие способности полимеров. Чтобы оценить различные растворители на совместимость с концевой частью катетера, а также их способность растворять полимер HIT, погрузите кусочки катетера в растворители и инкубируйте в течение 12 часов перед визуальной оценкой целостности катетера и прозрачности растворителя. Для анализа бактериального прикрепления на катетеры методом СЭМ готовят 10% раствор полимера в ацетоне.

Вдавите наконечник микропипетки объемом 200 микролитров в среднюю часть отрезанного куска катетера, чтобы удержать его, и вставьте кусочек в полимерный раствор примерно на 30 секунд. Высушите покрытый фрагмент в условиях окружающей среды в течение 30 минут, затем нанесите второе покрытие, снова погрузив кусочек катетера в полимерный раствор, и высушите в течение ночи при температуре окружающей среды. После инкубации кусочков катетера с покрытием и без покрытия в инокулированном LB, согласно текстовому протоколу, используйте один миллилитр PBS для промывания катетеров.

Затем используйте 10% параформальдегид в PBS для фиксации бактерий в течение 30 минут. После промывания PBS с помощью DAPI запачкайте бактерии на кусочках катетера в течение 20 минут. Перед мытьем с одним миллилитром PBS.

Наблюдайте за расположением образцов в камере. Используя следующие настройки, сделайте конфокальные снимки частей катетера. Завершите конфокальную визуализацию путем z-наложения 50 изображений на длине катетера 100 микрометров.

После УФ-обработки и инкубации с бактериями используйте один миллилитр PBS для двух мытья кусочков и переложите их в 48-луночные планшеты, содержащие 10% формальдегида в PBS, на 30 минут. После фиксации образцов проведите еще одну промывку PBS и просушите в течение ночи при комнатной температуре. Затем установите на заглушки с проводящими угольными дисками и используйте распылитель для нанесения покрытий до золотого покрытия.

Перед визуализацией с помощью сканирующего электронного микроскопа. На этом рисунке показано прикрепление бактерий к ряду полимеров, определенное с помощью анализа микрочипов. Пятна, напечатанные без полимера, выступают в качестве негативного контроля, так как агароза сильно сопротивляется связыванию бактерий и поэтому флуоресценция очень низкая.

Представленные полимеры являются связующими из сплава, хотя в большинстве случаев репеллентные свойства полимера значительно варьируются в зависимости от тестируемых видов бактерий. Это отражает значительные различия между механизмами привязанности у разных видов. Полимеры с низкой связующей связью легко идентифицируются при сравнении с агарозой.

Полимеры с высокой связываемостью, вероятно, будут идентифицированы в матрице и могут быть использованы в качестве положительного контроля для последующих экспериментов. Для полимеров, которые не проявляют автофлуоресценцию в канале DAPI, можно провести качественное сравнение изображений пятен визуально. Были проведены масштабные эксперименты по тестированию покрытий на больших поверхностях для подтверждения антибактериальных свойств 22 идентифицированных соответствующих полимеров.

Здесь представлены образцы с наилучшими характеристиками, используемые для нанесения покрытия на стеклозащитные стекла, проанализированные SEM. На этих рисунках показаны срезы катетера, проанализированные с помощью конфокальной микроскопии и СЭМ. Преимущество обоих микроскопических методов заключается в том, что они позволяют проводить прямой подсчет клеток на поверхности, обеспечивая однозначные данные, поскольку уменьшение прикрепления клеток легко заметно.

После этой процедуры компоненты сыворотки или крови могут быть проверены, чтобы определить их влияние на связывание бактерий. Животная модель может быть использована для оценки потенциала полимерных покрытий для клинического использования. Не забывайте, что работа с химическими веществами и патогенными организмами может быть опасной.

Кроме того, во время обработки и утилизации должны быть приняты необходимые меры контроля для снижения рисков для людей и окружающей среды.