Высокая пропускная способность идентификации бактерий репелленты Полимеры для медицинских приборов

Общая цель данного метода полимерных микромассивов заключается в выявлении синтетических полимеров, способных модулировать прикрепление бактерий к абиотическим поверхностям. Этот метод может ускорить поиск простых и экономически эффективных биоматериалов, которые препятствуют адгезии бактерий к медицинским изделиям. Основным преимуществом данной методики по сравнению с традиционными исследованиями биоматериалов, при которых каждый материал тестируется по отдельности, является возможность одновременного скрининга сотен полимеров в одном образце.

Для начала приготовьте растворы полимеров и добавьте их в лунки планшета на 384 лунки согласно текстовому протоколу. Создайте программу для печати полимеров в четырехкратном повторе, состоящую из 1536 пятен, расположенных в виде 48 рядов и 32 столбцов, печатая по 32 раствора полимеров за один раз, чтобы принтер можно было остановить после печати каждой секции для очистки пинов. Теперь поместите предметные стекла с агарозным покрытием на платформу и обеспечьте надежный вакуумный прижим для фиксации стекол в нужном положении.

Чтобы отрегулировать печатающую головку так, чтобы все пины находились на одном уровне, вручную опустите головку на предметное стекло и убедитесь, что пины поднимаются одновременно. Поместите многолуночный планшет на держатель так, чтобы лунка A1 находилась в верхнем правом углу держателя, и убедитесь, что планшет надежно зафиксирован. При появлении соответствующего запроса подтвердите, что предметное стекло и планшет установлены на своих позициях.

Печатайте по одной секции за раз, чтобы иметь возможность очистить штифты между секциями. Затем используйте бумажное полотенце, смоченное в ацетоне, для тщательной очистки штифтов. После этого протрите их сухой бумажной салфеткой, чтобы убедиться, что штифты полностью высохли.

После завершения печати микромассивов поместите их в держатель для предметных стекол и перенесите в вакуумный сушильный шкаф, настроенный на 40 °C, для удаления N&P из полимерных пятен. Затем подвергните пластины стерилизации ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут. Перед инокуляцией предметных стекол бактериями измерьте фоновую флуоресценцию в соответствии с текстовым протоколом.

После культивирования и подготовки инокулятов для микрочипов согласно текстовому протоколу, поместите стерилизованные ультрафиолетом полимерные микрочипы в прямоугольные четырехлуночные планшеты и добавьте шесть миллилитров смешанных бактериальных культур. Инкубируйте планшеты при 37 °C с осторожным перемешиванием в течение пяти дней. После инкубации осторожно промойте микрочипы дважды, используя PBS.

Затем добавьте DAPI в PBS в концентрации 1 мкг/мл и инкубируйте в течение 30 минут. После этого перенесите микромассивы в новую четырехлуночную планшетку, залейте их PBS и осторожно перемешайте круговыми движениями. Затем замените PBS один раз и повторите промывку.

После промывки высушите микрочипы потоком воздуха, затем нанесите герметизирующую пленку и прикрепите стеклянные покровные стекла к предметным стеклам с микрочипами. После высыхания клея используйте 70% ethanol для стерилизации внешней поверхности. С помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом 20x, сделайте одиночные снимки каждого полимерного пятна в светлом поле и в каналах соответствующего спектра.

Для нанесения полимеров на покровные стекла подготовьте растворы HIT-полимеров в тетрагидрофуране или другом подходящем растворителе. С помощью центрифугирующего устройства для нанесения покрытий (спин-коатера) нанесите растворы полимеров на круглые стеклянные покровные стекла подходящего размера при 2000 RPM в течение десяти секунд. Высушите покрытые стекла в конвекционной печи при 40 °C в течение ночи.

Используйте УФ-излучение для стерилизации покровных стекол в течение 30 минут перед инокуляцией бактериями. Поместите стерилизованные УФ-излучением покровные стекла в стандартный 12- или 24-луночный планшет и инкубируйте с бактериями, как было показано ранее в этом видео. После инкубации промойте покрытые стекла дважды 0,1 молярным какодилатным буфером, затем зафиксируйте образцы в течение двух часов, используя 2,5% (масса/объем) глутаровый альдегид и 0,1 молярный какодилатный буфер.

Проведите постфиксацию предметных стекол 1% раствором тетраоксида осмия в течение одного часа при комнатной температуре. Затем проведите дегидратацию в серии этанола по 30 минут при каждой концентрации. После этого с помощью напылителя и смеси сплава золота и платины в соотношении от 60% до 40% покройте образцы слоем при токе 30 мА и вакууме 0,75 торр.

После получения изображений с помощью СЭМ визуально сравните снимки непокрытых покровных стекол со снимками стекол, покрытых агарозой или HIT-полимерами, чтобы подтвердить способность полимеров связывать или отталкивать бактерии. Чтобы оценить совместимость различных растворителей с конечной частью катетера, а также их способность растворять HIT-полимер, погрузите фрагменты катетера в растворители и инкубируйте в течение 12 часов, после чего проведите визуальную оценку целостности катетера и прозрачности растворителя. Для анализа прикрепления бактерий к катетерам с помощью СЭМ приготовьте 10% раствор полимера в ацетоне.

Наденьте наконечник микропипетки на 200 мкл на среднюю часть отрезанного фрагмента катетера, чтобы зафиксировать его, и погрузите фрагмент в раствор полимера примерно на 30 секунд. Высушите покрытый фрагмент при комнатной температуре в течение 30 минут, затем нанесите второй слой покрытия, снова погрузив фрагмент катетера в раствор полимера, и оставить высыхать на ночь при комнатной температуре. После инкубации покрытых и непокрытых фрагментов катетера в инокулированной среде LB согласно текстовому протоколу, промойте катетеры 1 мл PBS.

Затем используйте 10% параформальдегид в PBS для фиксации бактерий в течение 30 минут. После промывки PBS используйте DAPI для окрашивания бактерий на фрагментах катетера в течение 20 минут. После чего промойте одним миллилитром PBS.

Оцените расположение образцов в камере. Используя следующие настройки, получите конфокальные изображения фрагментов катетера. Завершите конфокальную визуализацию, создав z-стек из 50 изображений вдоль участка катетера длиной 100 мкм.

После УФ-облучения и инкубации с бактериями дважды промойте образцы одним миллилитром PBS, затем перенесите их в 48-луночные планшеты, содержащие 10% формальдегид в PBS, на 30 минут. После фиксации образцов проведите еще одну промывку с помощью PBS и высушите их в течение ночи при комнатной температуре. Затем закрепите образцы на держателях с проводящими углеродными дисками и нанесите золотое напыление с помощью распылительного напылителя.

Перед получением изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа. На данном рисунке показано прикрепление бактерий к ряду полимеров, определенное с помощью микрочипового анализа. Пятна, нанесенные без полимера, служат отрицательным контролем, так как агароза сильно препятствует связыванию бактерий, и, следовательно, интенсивность флуоресценции очень низкая.

Представленные полимеры обладают способностью связываться со сплавом, хотя в большинстве случаев репеллентные свойства полимера существенно различаются в зависимости от тестируемого вида бактерий. Это отражает значительные различия в механизмах прикрепления у разных видов. Полимеры с низкой связывающей способностью легко определить путем сравнения с агарозой.

Полимеры с высокой связывающей способностью, вероятно, будут выявлены в массиве и могут быть использованы в качестве положительных контролей для последующих экспериментов. Для полимеров, не проявляющих автофлуоресценции в канале DAPI, качественное сравнение изображений пятен можно провести визуально. Были проведены эксперименты по масштабированию для проверки покрытия более крупных поверхностей с целью подтверждения бактерий-отталкивающих свойств 22 выявленных подходящих полимеров.

Здесь представлены наилучшие образцы, использованные для покрытия стеклянных покровных стекол, проанализированные с помощью СЭМ. На этих рисунках показаны срезы катетера, проанализированные с помощью конфокальной микроскопии и СЭМ. Оба метода микроскопии позволяют проводить прямой подсчет клеток на поверхности, что обеспечивает получение однозначных данных, так как снижение адгезии клеток легко визуализируется.

После выполнения данной процедуры можно протестировать сыворотку или компоненты крови, чтобы определить их влияние на связывание бактерий. Для оценки потенциала полимерных покрытий для клинического применения может быть использована модель на животных. Помните, что работа с химическими веществами и патогенными организмами может быть опасной.

При обращении и утилизации должны быть приняты необходимые меры контроля для снижения рисков для персонала и окружающей среды.