Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция

Общей целью данного метода иммунопреципитации РНК является селективная изоляция и характеристика эндогенных белковых комплексов РНК, образующихся в эукариотических клетках с помощью специфического обогащения олигонуклеотидами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области посттранскрипционного контроля, такие как состав РНК-связывающих белков, которые определяют пять основных UTR ретровирусного транскрипта для регуляции экспрессии его генов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет исследователю избирательно выделять и характеризовать конкретный комплекс РНК-белков, представляющий интерес, сохраняя при этом возможность проведения более глобального анализа РНК ниже по потоку.

Что ж, применение этого метода простирается на фундаментальное понимание вирусных инфекций и многочисленных клеточных заболеваний. И дает значительное представление о механизмах посттранскрипционного контроля экспрессии генов. Это может означать появление новых жизнеспособных мишеней для лекарств.

После культивирования клеток и проведения иммунопреципитации белка, меченного FLAG, в соответствии с текстовым протоколом, переведите 60 микролитров на ИП суспензии магнитных шариков pro-TG в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 миллилитров. Поместите пробирку на магнитный штатив и удалите раствор для хранения, тщательно пипетируя. Затем снимите трубку со стойки.

Добавьте 600 микролитров 1x буфера для стирки. И поместите трубку на торцевой вращатель при комнатной температуре на три минуты, чтобы промыть и уравновесить бусины. Поместите трубку на магнитную решетку и снимите буфер для промывки.

Затем добавьте 10 объемов свежего 1x буфера для стирки. Добавьте иммунопреципитирующие антитела FLAG к уравновешенным про-TG магнитным шарикам. А затем вращают трубку при комнатной температуре не менее 30 минут, чтобы конъюгировать иммунопреципитирующее антитело.

Поместите трубку на магнит и удалите надосадочную жидкость. Затем снимите тюбик с магнита и добавьте 1x буфер для промывки к бусинам и вращайте при комнатной температуре в течение трех минут. Повторите этап промывки дважды и удалите последний буфер.

Удалите питательную среду из клеток путем аспирации и используйте 1,5 миллилитра ледяного PBS для двукратной промывки клеток. С помощью скребка для клеток выбивают влажные, прилипшие клетки. Пипетируйте клеточную суспензию в свежие пробирки, а затем центрифугируйте культуру при температуре 226 раз G в четырех градусах Цельсия в течение четырех минут.

Добавьте 375 микролитров ледяного буфера с низким содержанием соли в клеточную гранулу и инкубируйте образец на льду в течение пяти минут, чтобы обеспечить набухание. Важно соблюдать осторожность при добавлении и повторном суспендии клеточной гранулы в буфере с низким содержанием соли, чтобы обеспечить полное погружение и набухание без преждевременного механического разрушения. Чтобы собрать лизат цитоплазматических клеток, добавьте 125 микролитров ледяного буфера для лизиса, а затем с помощью предварительно охлажденного гомогенизатора Dounce выполните десять ударов.

Dounce гомогенизируется с силой, достаточной для обеспечения лизиса плазматической мембраны и загрязнения высвобождающегося цитоплазматического лизата. Но будьте осторожны, чтобы не переусердствовать с механическим разрушением и не рисковать ядерным загрязнением, разрушением белкового комплекса РНК или потерей высвобожденного гомогената в микрофуге на максимальной скорости в течение одной минуты. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую 1,7-миллилитровую трубку, которая была на льду.

Определите общую концентрацию белка. Резерв 10% для анализа вестерн-блоттинга, который будет использоваться в качестве входного контроля. Чтобы провести иммунопреципитацию, добавьте нужный объем собранного клеточного лизата к конъюгированным шарикам антител.

Используя 1x буфер для промывки, доведите общий объем до 600 микролитров и вращайте образец при комнатной температуре. После 90 минут инкубации поместите IP-пробирку на магнитную решетку, чтобы собрать бусины. Затем соберите надосадочную жидкость и оставьте ее в качестве проточной.

Затем добавьте 10 объемов ледяного промывочного буфера NETN 150 в связанный с RNP, конъюгированные гранулы антител и вращайте образец при комнатной температуре в течение трех минут. После повторного суспендирования иммобилизованных комплексов РНП в 1х связывающем буфере в соответствии с текстовым протоколом отрегулируйте оставшийся объем в 100 микролитрах ледяного 1х связывающего буфера. И нагреваем трубку до 70 градусов Цельсия в течение трех минут.

Чтобы выделить родственные белковые комплексы РНК, добавьте олигоолигон из примерно 30 нуклеотидов ДНК, комплементарный границе трех простых последовательностей интересующей РНК. И высиживать 30 минут при комнатной температуре при щадящем покачивании. Добавьте в пробирку от пяти до десяти единиц РНКазы H и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы отделить РНК от гибрида РНК ДНК.

Затем перенесите надосадочную жидкость, содержащую интересующие захваченные комплексы РНП, в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Для сбора иммунопреципитированной РНК повторно суспендируют половину общего образца захваченных комплексов РНК в 750 мкл кислотного реагента гуанидиния тиоцианата. Добавьте в тюбик 200 микролитров хлороформа, энергично встряхивайте в течение 10 секунд и выдерживайте при комнатной температуре в течение трех минут.

После центрифугирования соберите водную фазу в свежую пробирку, и добавьте равный объем изопропанола. Хорошо перемешайте и выдержите образец при комнатной температуре не менее десяти минут. Добавьте один микролитр гликолевого синего в образец и храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия для эффективного осаждения или обработки в будущем.

Центрифугируйте пробирку при температуре 16 000 раз G в четырех градусах Цельсия в течение десяти минут. Используйте микропипетку P200 для тщательного сбора и утилизации надосадочной жидкости, чтобы не повредить гранулу РНК. Добавьте по 500 микролитров 75%-ного этанола в каждую тюбик.

Вортексируйте и центрифугируйте пробирки в течение пяти минут. Аккуратно соберите и выбросьте надосадочную жидкость, как показано только что на рисунке. Высушите гранулу на воздухе в течение двух-трех минут и используйте 100 микролитров воды, не содержащей РНКазы, чтобы повторно суспендировать ее.

Нанесите 100 микролитров образца РНК на колонку для очистки РНК. И обрабатывайте его в соответствии с протоколом производителя. Наконец, разбавьте РНК в 30 микролитрах воды, свободной от РНКазы, и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до трех месяцев.

Выделять посттранскрипционные контрольные элементы, или ПХЭ, ГАГ, РНК, RHA рибонуклеопротеиновые комплексы, образующиеся в пролиферирующих клетках. Иммунопреципитацию РНП FLAG-MS2 проводили в трансфицированных HECK293 клеточных лизатах. Результаты показывают эффективное осаждение белка FLAG-MS2.

Поскольку DHX9/RHA обнаруживается в комплексе RNP, а не в контроле изотопа IgG или в отрицательном контроле. Здесь показаны вестерн-блоттинги из комплексов ДНК РНКазы H, расщепленной РНК. РНКаза H расщепляет PCE GAG RNA, высвобождая комплекс RNP, специфически связанный с пятью простыми UTR.

Ассоциированные с DHX9/RHA RNP были обогащены элюентами. Важно отметить, что связанные с FLAG-MS2 RNP остались с конъюгированными гранулами антител. В этом эксперименте иммунопреципитация HO стволовой петли MS2, содержащей ретровирусную PCE GAG РНК в клетках и элюентах, была валидирована с помощью ОТ-ПЦР и QRT-ПЦР.

Результаты подтвердили выбранную связь между DHX9/RHA и ретровирусным пятипервичным UTR, который был выделен как уникальный RNP, важный для целенаправленного контроля трансляции. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять часов, если она выполнена правильно. Выполняя эту процедуру, важно помнить о том, что все шаги должны выполняться эффективно и с осторожностью, чтобы обеспечить поддержание неповрежденных комплексов РНП и изоляцию конкретного комплекса РНП, представляющего интерес

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как масс-спектрометрия и РНК-Seq, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как глобальная ассоциация белка с целевой РНК. А также региональный или полный анализ всех транскриптов, задействованных в рамках конкретного RNP. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области посттранскрипционного контроля генов к изучению различных белковых комплексов РНК, регулирующих истечение срока действия патогенных вирусных генов и общий механизм контроля экспрессии клеточных генов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собирать интактные клеточные комплексы РНП и определять их состав с помощью селективного направленного обогащения олигонуклеотидами. Не забывайте также, что работа с патогенными вирусами и биологическими образцами и опасными химическими веществами, такими как кислота или фенол, может быть чрезвычайно опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует принимать все меры предосторожности, такие как соответствующие средства индивидуальной защиты.