Поток-сортировка и экзомерная секвенирование клеток Рида-Штернберга классической лимфомы Ходжкина

Общая цель этой процедуры заключается в отделении и концентрации жизнеспособных клеток Ходжкина, Рида-Штернберга или HRS из воспалительных лимфоцитарных классических лимфом Ходжкина или опухолей CHL для получения и анализа высококачественных данных секвенирования цельного экзома следующего поколения. Этот метод может ответить на ключевые вопросы биологии CHR, включая идентификацию ключевых драйверных мутаций, мутаций ускользания от иммунитета, а также рассмотрение генного разнообразия в классификации. Этот метод позволяет получить опухолевую ДНК очень высокого качества и чистоты.

Облегчение создания библиотек секвенирования нового поколения без необходимости предварительного амплификации. Этот метод может иметь важное значение для диагностики лимфомы Ходжкина, поскольку он может помочь с подклассификацией и прогнозированием. Это также может повлиять на выбор терапии, поскольку некоторые изменения могут указывать на восприимчивость или устойчивость к определенным препаратам.

Джонатан Фром впервые пришел к этой идее, когда он обнаружил, как визуализировать клетки HRS с помощью проточной цитометрии и провел первые эксперименты по сортировке этих клеток. Перед подготовкой клеток смешайте предварительно заправленные антитела во флаконе из темного стекла. Затем добавьте PBS и BSA, чтобы довести объем коктейля антител до 100 микролитров.

И переложите флакон из жидкого азота в ведро со льдом или сухой лед. Далее быстро разморозьте интересующие клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Когда останется только небольшая замороженная порция, вылейте клетки в 50-миллилитровую коническую пробирку, содержащую 45 миллилитров среды для размораживания при температуре 37 градусов Цельсия, и промойте криогенный флакон два раза одним миллилитром свежей среды для размораживания.

После объединения обоих полосканий дайте клеткам перевариться при комнатной температуре в течение 15 минут. Когда клетки снова уравновесятся, соберите их центрифугированием. Аспирируйте все, кроме последних 200 микролитров надосадочной жидкости.

Снова суспензируйте клетки в оставшейся оттаивающей среде и дайте клеткам отдохнуть еще две-три минуты. Затем инкубируйте клетки в 100 микролитрах коктейля антител в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света. По окончании инкубации промыть ячейки в трех миллилитрах сортировочной среды, повторно суспензив гранулу в одном миллилитре свежей сортировочной среды.

Затем отфильтруйте клетки через верхнее ситечко проточной трубки объемом пять миллилитров. Промойте пробирку и ситечко еще одним миллилитром сортировочной среды, и подержите клетки на льду. Перед началом сортировки клеток в программном обеспечении проточного цитометра в меню эксперимента выберите «Новый эксперимент» и откройте окно состояния прибора.

На вкладке параметров удалите все неиспользуемые параметры. Затем снова откройте вкладку эксперимента и выберите настройку компенсации, чтобы создать элементы управления компенсацией. В окне браузера щелкните знак плюса, чтобы развернуть контрольный образец компенсации, и запустите контрольные трубки компенсации без записи данных.

При необходимости отрегулируйте напряжение детектора таким образом, чтобы количество положительно окрашенных гранул для каждого хрома флоры находилось в диапазоне от 10 000 до 100 000 каналов. И из самых ярких в их первичном канале обнаружения. Запишите напряжения, необходимые для каждого параметра для каждой трубки.

Затем под контрольным образцом компенсации щелкните левой кнопкой мыши, чтобы выделить неокрашенную контрольную трубку и загрузить неокрашенную контрольную трубку на предметный столик образца. В окне управления сбором данных нажмите кнопку «Загрузить» и запустите отдельные элементы управления компенсацией в поля напряжения детектора для всех параметров, чтобы вручную ввести определенные напряжения. Нажмите кнопку записи, чтобы получить неокрашенные контрольные данные.

Затем запустите все оставшиеся элементы управления компенсацией, записывая данные без изменения настроек детектора. Когда все элементы контроля будут проанализированы, проведите по трубке со стерильной деионизированной водой в течение пяти минут, чтобы очистить прибор от остатков материала, прежде чем продолжить. Чтобы включить ячейки для сортировки HRS, загрузите экспериментальную трубку и зарегистрируйте не менее 100 000 событий, регулируя скорость потока для получения от 3 000 до 4 000 событий в секунду.

Убедитесь, что вы записали достаточно событий, чтобы визуализировать популяцию, которая может составлять всего одну из 1000 клеток. Для идентификации соматических В- и Т-клеток можно определить CD20 и CD5-положительные клетки соответственно. Когда все затворы будут установлены, отсортируйте клетки в предварительно охлажденные 15-миллилитровые конические пробирки, содержащие от семи до восьми миллилитров среды для сбора.

В конце сортировки перенесите изолированные клеточные популяции в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. И гранулировать клетки методом центрифугирования. Затем промойте клетки в одном миллилитре свежего PBS и удалите надосадочную жидкость из каждой пробирки, стараясь не потревожить крошечные гранулы.

После усиления библиотеки и очистки шариков по точке 8X следует наблюдать нормальное распределение размеров фрагментов в нужном диапазоне. Библиотеки, которые демонстрируют отклонения от этой формы, указывают на наличие артефакта с высокой или низкой молекулярной массой, и в идеале не должны быть секвенированы. Например, димер адаптера может иногда переноситься через первую очистку заостренного X-образного шва, проявляясь в виде острого пика с центром вокруг 125-130 пар оснований.

В этом случае следует выполнить дополнительную очистку заостренного Х-образного шва с последующей повторной визуализацией распределения размеров, чтобы обеспечить успешное удаление димера. После мультиплексного секвенирования четырех образцов на полосу можно достичь медианной глубины покрытия от 50 до 100 раз по всей мишени. Хотя графики числа копий, созданные из библиотеки в один нанограмм, могут привести к ложному увеличению и потере числа копий.

Примерно 70% случаев классической лимфомы Ходжкина являются носителями мутаций B2M и 820 и/или делеций, которые, по-видимому, являются клональными, и которые могут быть использованы для оценки относительного содержания опухоли. Если Т-клетки используются в качестве соматического контроля, секвенирование HRS продемонстрирует значительное увеличение числа копий в позициях, соответствующих альфа-, дельта- и бета-позициям Т-клеточных рецепторов. А также значительные потери в позициях тяжелых рецепторов В-клеток и легких цепей каппы с общей мутационной нагрузкой от 100 до 400 соматических мутаций на случай экзома.

После освоения этого метода, включая сортировку клеток и построение библиотеки секвенирования, можно завершить за три-четыре дня, если он выполнен правильно. Следуя этой процедуре, мы можем проводить более масштабные проспективные исследования и другие методы, такие как эпигенетика, протеомика и метабаломика, чтобы получить больше знаний о лимфоме Ходжкина и продвинуться в направлении более специфических персонализированных методов лечения. После его разработки метод позволил нам изучать HRS-клетки с высокой чистотой в относительно большом количестве.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить клетки HRS и начать их геномный анализ.