Улучшенная полимеразная цепная реакция-рестрикционного фрагмента полиморфизма длины генотипирование Toxic Pufferfish методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

Общая цель данного эксперимента заключается в проведении быстрого и точного генотипирования токсичных рыб фугу путем анализа небольших ампликонов ПЦР. Съедобная часть рыбы фугу, которая используется для приготовления блюда из рыбы фугу, варьируется в зависимости от ее вида, и некоторые виды содержат токсины по всему организму. Эта мышечная база данных и масу, и плавник, и родившаяся кожа рыбы фугу могут помочь в генотипировании рыбы фугу с точки зрения полной безопасности пищи для всех и для исследований.

Чтобы провести экстракцию ДНК с помощью набора, сначала поместите от 30 до 50 миллиграммов ткани рыбы в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 или 1,5 миллилитров. Раздавите ткань без плавника и кожи, используя микрошпатель. Добавьте 180 микролитров буфера для лизиса тканей животных и 40 микролитров протеиназы К и вортекса кратко.

Инкубировать при температуре 56 градусов Цельсия на блочном нагревателе в течение двух часов или на ночь. Центрифугируйте образец в течение пяти минут при 13000xg. После переноса надосадочной жидкости в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавьте 200 микролитров хаотропного буфера, содержащего гуанидина гидрохлорид, из набора.

Затем добавьте 200 микролитров 99,5% этанола и перемешайте путем вортексирования. Перелейте смесь, включая любой осадок, в спиновую колонну, помещенную в двухмиллилитровую сборную трубку. После центрифугирования в течение одной минуты при 13000xg выбросьте проточный поток.

Добавьте 500 микролитров промывочного буферного, содержащего гуанидина гидрохлорид из набора, и центрифугируйте как раньше. Выбросьте проточный канал и сборную трубку. Поместите спиновую колонку в новую двухмиллилитровую пробирку для сбора, входящую в комплект.

Добавьте 500 микролитров промывочного буфера два и центрифугируйте в течение трех минут при температуре 20 000xg. После отбрасывания проточной и сборной трубки переведите спиновую колонну в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Пипеткой впрыскивают 200 микролитров элюирующего буфера в центр мембраны спин-колонки.

Через одну минуту центрифугируйте в течение одной минуты при 6000xg. Затем пипеткой нанесите 50 микролитров алюэта на одноразовую ультрафиолетовую кювету. Измерьте ультрафиолетовый спектр алюэта на расстоянии от 220 до 300 нанометров и поглощение на глубине 260 нанометров с помощью спектрофотометра.

Использование реагента без детергента имеет решающее значение для успеха жидкостной хроматографии, потому что реагент действительно может повредить аналитическую колонку. Работая на чистом стенде во избежание загрязнения, установите ПЦР на 25 микролитров для каждого извлеченного образца ДНК, положительный контроль и отрицательный контроль, на льду, как описано в текстовом протоколе. Для удобства работы внесите достаточное количество коктейля, содержащего все реагенты без матричной ДНК и диспонируйте его.

Используйте ДНК-полимеразу, обладающую корректурной активностью, чтобы избежать добавления трех основных адениновых выступов в продукт ПЦР. Проведение амплификации ПЦР на термоамплификаторе с использованием циклической программы, показанной в текстовом протоколе. Для проведения ферментативного расщепления добавьте в раствор ПЦР два микролитра буфера ферментативного разложения.

Добавьте по одному микролитру каждого фермента рестрикции и аккуратно перемешайте. Инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в термическом амплификаторе, а затем в течение пяти минут при температуре 72 градуса Цельсия. Отфильтруйте реакционный раствор с помощью центробежного фильтрующего устройства размером от 0,2 до 0,5 микрона, чтобы предотвратить засорение и не повредить аналитическую колонку.

Переложите фильтрат в конический полипропиленовый флакон и храните при температуре 20 градусов Цельсия до анализа. Приготовьте раствор гексафторизопропанола и триэтиламина в литровой бутылке, как описано в текстовом протоколе. Подсоедините флакон к линии А прибора жидкостной хроматографии, охлаждая флакон с помощью портативного холодильника с прямым охлаждением, чтобы предотвратить испарение.

Подсоедините еще одну бутылку, наполненную метанолом, к линии В. Подсоедините защитную колонку и аналитическую колонку к прибору. Начните протекание начальной подвижной фазы, чтобы уравновесить колонны. Если вы используете масс-спектрометр без программного обеспечения для управления давлением C-Trap, вам необходимо снизить давление C-Trap путем ручного управления баром.

Для этого потяните ручку, чтобы разблокировать, и очень медленно поверните ручку против часовой стрелки, чтобы снизить высокое давление вакуума до 1/3. Указанное давление должно изменяться постепенно с задержкой. Игнорируйте предупреждающее сообщение о низком давлении.

Нажмите на ручку до упора. После настройки на калибровку, как описано в текстовом протоколе, переместите нагретый зонд ионизации электрораспылением ближе к границе раздела масс-спектрометра в положение В. Подключите к зонду и шприцу с помощью трубки. Вливайте калибр постоянно со скоростью потока 10 микролитров в минуту с помощью встроенного шприцевого насоса.

Проверьте только шесть ионов с меньшей массой в специальной калибровочной таблице. Приступайте к калибровке после стабилизации интенсивности сигналов. После калибровки проверьте только шесть ионов с большей массой и приступайте к калибровке.

Избегайте калибровки с использованием всех ионов сразу, чтобы избежать отказа. Переместите зонд в положение D для скорости потока 0,4 миллилитра в минуту и подсоедините к прибору с помощью инертной металлической трубки. После настройки параметров, как описано в текстовом протоколе, очистите пузырьки, постукивая по дну флаконов.

Установите флаконы с образцами на штатив для образцов и введите один микролитр образца с помощью автосамплера, чтобы начать анализ. Откройте файлы необработанных данных с помощью программного обеспечения браузера и убедитесь, что все сборы данных успешно завершены, включая положительный и отрицательный контроль. Настройте метод, как описано в текстовом протоколе, а затем нажмите кнопку «Выполнить» на вкладке «Запустить подсказку», чтобы запустить программное обеспечение для деконволюции.

После того, как подсказка будет завершена, выберите строку и нажмите кнопку «Открыть результат» в верхнем заголовке, чтобы получить результаты деконволюции. Вот типичная хроматограмма общего ионного тока, полученная из отрицательного контроля и образца рыбы фугу. Каждый пик представляет собой дуплекс ДНК, который разделяется в зависимости от их длины.

В этом примере наблюдаются три пика от образца рыбы фугу. Эти пики являются результатом расщепления ампликонов с использованием двух эндонуклеаз. В отрицательном контрольном образце пиков не наблюдается.

Каждый пик представляет собой масс-спектр, состоящий из многократно заряженных ионов. Расширение масс-спектра позволяет сделать заметными десятки пиков с изотопным разрешением. Это разрешение является необходимым условием для определения моноизотопной массы и возможно только с помощью масс-спектрометра с высоким разрешением.

В этом примере моноизотопные массы третьего пика равны 16296,7656 и 16468,6616 дальтонам. Учитывая допуск по массе в три ppm, измеренные значения идентичны теоретическим значениям такифугу, показанным здесь. После освоения этой техники ее можно сделать за один день с помощью обычных инструментов и аппаратов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать малые ампликоны с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения для генотипирования. Метод может быть применен при анализе других полиморфизмов ДНК при условии, что вариация последовательности отражается в малых ампликонах, подлежащих анализу. Однако этот метод идентифицирует только базовые композиции, подмену основания в рамках одного меркурия отличить не удается.