Опробование Хищные кормления поведений Pristionchus И другие нематоды

Общая цель этих процедур состоит в том, чтобы надежно проанализировать сложное пищевое поведение хищных нематод с использованием нескольких новых анализов. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области поведенческой нейробиологии, такие как регуляция нового сложного поведения и, конечно же, эволюция. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они обеспечивают быстрые, легко повторяемые методы для наблюдения и количественной оценки хищнического пищевого поведения у нематод, включая спутниковую модель организма Pristionchus pacificus.

Чтобы визуализировать ротовые морфы нематоды, сначала обездвижите червей с помощью мягкой анестезии на свежеприготовленной 2%-ной агарозной прокладке. Чтобы сделать подушечку, аккуратно добавьте 10 микролитров 10%-ного раствора азида натрия в три миллилитра растопленной агарозы и тщательно перемешайте. Азид натрия является реакционноспособным и токсичным, поэтому принимайте надлежащие меры предосторожности.

Затем капните не менее 300 микролитров смеси на середину стандартного предметного стекла микроскопа и используйте другое предметное стекло, чтобы расплющить агарозу. Оставьте верхнюю горку в нужном положении до тех пор, пока подушка не будет использована. Чтобы подготовить подушечку к использованию, снимите верхнюю горку и добавьте каплю М9. Затем сорвите два-три червячка, поместите их в каплю и аккуратно наложите укрывной лист.

Наблюдайте за червями с 63-кратной оптикой Номарского, чтобы классифицировать их морфообразную идентичность. Увеличенный спинной зуб, дополнительный субвентральный зуб или увеличенное широкое отверстие рта – все это признаки эвристоматозного животного. Тогда как один спинной зуб и более узкое отверстие рта указывают на стеностоматозное животное.

В течение пяти минут извлеките нематод из обезболивающей прокладки. Аккуратно снимите крышку и переложите их на свежую пластину MGM. Подождите, пока они проявят двигательное поведение, прежде чем проводить дальнейший анализ.

С большим опытом морф может быть исследован без анестезии. Перенесите от 10 до 20 нематод со стандартной культуральной пластины на свежую тарелку, засеянную бактериальной лужайкой OP50, для быстрого фенотипирования полости рта с помощью стереомикроскопа с большим увеличением. Затем обнаружьте различия в размере и ширине рта.

При таком увеличении не наблюдаются структуры, похожие на зубы, поэтому определяйте морфы рта на основе их ширины. Таким образом отличают широкие рты от узких. Изготовьте пробирные пластины, вырастив большое количество личинок выбранной добычи нематоды, таких как личинки стадии C.elegans или подходящая экологически значимая добыча.

Морите голодом четыре или более тарелки добычи, чтобы собрать личинок L1. Позже вымойте пластины с помощью М9 и пропустите сбор через два фильтра по 20 микрон. В растворе должны остаться только мелкие личинки.

Гранулируйте личинки по 377 г в течение минуты. Удалите надосадочную жидкость М9 в стакан для отходов и возьмите три микролитра чистой гранулы червя. Положите червей в центр шестисантиметровой пластины MGM без кишечной палочки и дайте им разрастись примерно на полчаса.

Позже используйте личинки для анализа укусов. Перенесите хищников на пробирную пластину с минимальным количеством бактерий OP50. Для P.pacificus добавьте в тарелку пять хищников.

Подождите 15 минут, чтобы переведенные животные оправились от стресса. Через 15 минут черви должны двигаться нормально, иначе они могут быть повреждены. Теперь наблюдайте и записывайте отдельные события одного из хищников в течение 10 минут.

Кусание характеризуется тем, что хищник ограничивает движение добычи. Умерщвление происходит, когда кутикула добычи открыта. Кормление характеризуется заметным поеданием внутренностей добычи.

Наблюдайте не менее чем за 10 отдельными хищными нематодами, чтобы убедиться в точности. Накачку глотки и движение зубов можно наблюдать под оптикой Nomarski при увеличении от 40 до 63x и регистрировать с помощью высокоскоростной камеры с частотой 50 Гц. После записи 15-секундных роликов не менее 20 животных видео можно надежно анализировать.

Откачка наблюдается в корпусе, расположенном в середине глотки. Движение зуба обнаруживается в ротовом отверстии и наблюдается только со стороны тыльного зуба. После двух часов хищничества закройте тарелку на наличие пустых трупов.

Идентифицируйте трупы по отсутствию подвижности и очевидным морфологическим дефектам, включая протекающие внутренности или отсутствующие фрагменты червей. После успешной идентификации подходящей ротовой морфы у P.pacificus наблюдались четкие различия между эвристоматозными и стеностоматозными животными. Только эвристоматозные животные занимались убийственным поведением.

Кроме того, различия в активности зубов и накачке глотки эвристаматозными животными на бактерии и добычу также очевидны. Во время хищнического кормления скорость откачки снижается ниже уровня, наблюдаемого при бактериальном кормлении, а движение зубов равномерно при глоточной откачке. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как объединить эти различные анализы, чтобы охарактеризовать сложное хищническое пищевое поведение у нематод, в том числе в спутниковой модели организма Pristionchus pacificus.