Аффинное мечение Обнаружение эндогенного Рецепторы из эмбрионов данио рерио

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обнаружить рецепторы фактора роста с низким содержанием у эмбрионов рыбок данио-рерио путем объединения селективности и чувствительности аффинного мечения выбранного рецептора его радиоактивным лигандом. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области биологии развития, такие как уровни экспрессии рецепторов и их биохимические свойства. Этот метод, который мы прозвали AFLIP, расширяет мощные описательные качества аффинного мечения, хорошо зарекомендовавшего себя метода клеточной биологии для исследований развития рыбок данио.

Чтобы начать эту процедуру, соберите от 100 до 200 эмбрионов для каждого состояния и поместите их в чашки Петри, содержащие рыбью воду. Затем вручную дехорионизируйте эмбрионы с помощью щипцов с тонкими наконечниками и избегайте использования проназы или любой другой протеазы на протяжении всего протокола, так как она может переварить целевые рецепторы. Затем поместите эмбрионы в 1,5-миллилитровую микропробирку и дважды промойте их 1X PBS.

Затем добавьте 500 микролитров дейолкинга буфера. Освободите большую часть желтка, аккуратно дозируя эмбрионы в растворе вверх и вниз примерно от 30 до 40 раз. Для 72 эмбрионов HPF и 48 HPF используйте синие и желтые наконечники для пипеток соответственно.

Желтые кончики, возможно, придется слегка подрезать, чтобы избежать уничтожения эмбрионов. Успешное высвобождение желтка можно проверить, наблюдая за эмбрионами под микроскопом. Удаление желтка должно быть как можно более полным, так как липиды и белки желтка могут препятствовать последующим этапам связывания лигандов или антител.

После этого соберите эмбрионы центрифугированием при 600 х г в течение 15 секунд. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки. Затем дважды промойте эмбрионы 500 микролитрами буфера для стирки, аккуратно вортируя их на самой низкой скорости.

Затем соберите эмбрионы центрифугированием при 600 х г в течение 15 секунд. С этого момента продолжайте процедуру при температуре четыре градуса Цельсия. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.

После этого мы суспендируем эмбрионы в 350 микролитрах буфера для лизиса и гомогенизируем их с помощью пластикового пестика. Затем инкубируйте лизированные эмбрионы в течение 30 минут с перемешиванием на коромысле из пробирки при температуре четыре градуса Цельсия. Затем центрифугируйте лизированные эмбрионы при давлении 11 000 x g в течение 15 минут, чтобы удалить нерастворимый мусор.

После этого переложите очищенную надосадочную жидкость в свежую пробирку. Определите общий белок с помощью анализа белка по Брэдфорду и калибровочной кривой. На этом этапе поместите от 400 до 500 микрограммов общего белка эмбриона в микропробирку объемом 1,5 миллилитра и разбавьте его до одного микрограмма на микролитр с помощью буфера 1.

Затем добавьте йод-125 этикетку TGF-beta II в приклад до конечной концентрации 150 пикомоляр и инкубируйте с перемешиванием на коромысле из пробирки в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. После этого добавьте неразведенное антитело против интересующего рецептора, чтобы достичь разведения 1:100. Затем продолжайте инкубацию при четырех градусах Цельсия еще два часа или на ночь.

После инкубации добавьте 50 микролитров подходящих шариков, связывающих иммуноглобулин, и инкубируйте в течение 50 минут с перемешиванием на коромысле из пробирки при четырех градусах Цельсия. Затем соберите шарики с помощью микроцентрифугирования при давлении 11 000 x g в течение 20 секунд и выбросьте надосадочную жидкость в соответствующий контейнер для радиоактивного мусора. Затем промывайте шарики IP три раза одним миллилитром буфера для промывки IP путем вортексирования на микроцентрифугировании при 11 000 x g в течение 20 секунд каждый раз.

Затем снова суспендируйте шарики IP в 250 микролитрах буфера для промывки IP. Приготовьте свежий раствор ДСС и добавьте его в пробу 1,5 микролитра. После этого инкубируйте образец в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия с перемешиванием.

Чтобы погасить реакцию сшивания, добавьте 500 микролитров промывочного буфера IP, дополненного достаточным количеством тристхлорида при pH 7,4, чтобы получить 25 миллимолярных тристхлоридов. Затем центрифугируйте при 11, 00 x g в течение 20 секунд, чтобы собрать шарики IP. После этого выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулы IP в 30 микролитрах буфера для восстановления леммли.

Далее прокипятите образец при температуре 94 градуса Цельсия в течение пяти минут перед электрофорезом геля SDS-PAGE, а затем проанализируйте высушенные гели в люмиметре или с помощью обычной авторадиографии. На этом рисунке показаны репрезентативные результаты, полученные с помощью AFLIP. Общий белок, экстрагированный из эмбрионов при 72 hpf и 48 hpf, подвергали мечению Iodine-125 TGF-beta II affinity с последующим IP-выделением с помощью кролика против данио-рерио или кролика против крысы BG в качестве контроля.

При проведении авторадиографии БГ может быть обнаружена без ГАГ или в виде гликозаминогликан-модифицированной БГ. На этом рисунке показано, как AFLIP может быть использован для измерения уровней экспрессии данного рецептора у эмбрионов, подвергшихся экспериментальной манипуляции, в данном случае снижения бетагликана до введения морфолино. Первая полоса показывает уровень бета-рецептора TGF III в эмбрионе дикого типа размером 72 hpf, в то время как вторая полоса показывает эффект введения семи нанограммов морфолино, направленных на границу экзона 2-интрона 2 первичного транскрипта ZFPG. Следует отметить, что подавление БГ, полученное с помощью этого морфолино, не воспроизводится его несогласованным контролем.

Эти результаты подтвердили, что фенотип, полученный с этим морфолино, был специфичен для нокдауна бета-рецептора TGF III, как описано ранее. Успех AFLIP в обнаружении фактора роста или цитокиновых рецепторов зависит от доступности меченого радиоактивным лигандом, который может быть связан и сшит с его рецептором. Также требуется хорошее антитело для иммунопреципитации.

После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. Поскольку AFLIP позволяет избежать этапа переноса вестерн-блоттинга, он позволяет лучше обнаруживать рецепторы с высокой степенью гликозилирования. И мы видели здесь для протеогликана бетагликан, который очень неэффективно переносится при вестерн-блоттинге. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ферментативное расщепление, чтобы описать дополнительную посттрансляционную модификацию, при условии, что они выявляются с помощью электрофоретических методов.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как AFLIP может помочь вам обнаружить рецепторы с низким содержанием в нескольких эмбрионах рыб с помощью аффинного мечения, связанного с иммунопреципитацией. Наконец, не забывайте, что работа с йодом-125 должна производиться с осторожностью и адекватной защитой. Удачи в ваших экспериментах.