Получение однородных образцов MALDI для количественных измерений

Общая цель данного метода подготовки проб для MALDI MS заключается в снижении пространственной неоднородности ионных сигналов при MALDI MS. Для оптимизации традиционного метода высушивания капли была создана среда с контролируемым процессом сушки, позволяющая управлять гидродинамическими потоками внутри капли образца в процессе высыхания. Основным преимуществом данной методики является то, что пространственная неоднородность ионных сигналов для образцов, подготовленных оптимизированным методом высушивания капли, может быть эффективно снижена. Данный метод позволяет получать гомогенные образцы для метрической системы THAP.

Данный метод также может быть применен к другим матричным системам, таким как альфа-циано-4-гидроксициннамовая кислота. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями, так как контроль условий высушивания представляет собой сложную задачу. Чтобы начать процедуру, откройте дверь сушильной камеры и немедленно поместите предварительно очищенную планшетку для образцов на медный блок.

Затем закройте дверцу. Вручную отрегулируйте расходомер, чтобы установить скорость потока азота на уровне 10 стандартных кубических футов в час. После этого точно настройте расходомер, чтобы относительная влажность в сушильной камере, измеряемая гигрометром, всегда оставалась ниже 25%.

Используя термопары K-типа для мониторинга температуры, вручную отрегулируйте температуру водяного циркулятора до тех пор, пока температура предметного стекла для образцов не достигнет 5 °C для проведения эксперимента. Перед нанесением образца убедитесь, что достигнуты требуемые значения температуры и относительной влажности. В микроцентрифужной пробирке смешайте 0,25 µL 0,1 M раствора THAP и 0,25 µL нужного аналита.

Перемешайте образец на вортексе в течение трех секунд. Затем центрифугируйте образец в течение двух секунд, чтобы собрать раствор на дне микроцентрифужной пробирки. После центрифугирования откройте дверцу сушильной камеры и с помощью пипетки осторожно нанесите 0,1 microliters раствора на планшет для образцов.

Немедленно закройте дверцу и дождитесь высыхания капли образца. При поддержании температуры планшета с образцом ниже температуры окружающей среды средняя скорость рециркуляционных потоков внутри капли значительно увеличивается для перераспределения молекул. Нанесение образца является наиболее критическим этапом, определяющим качество и воспроизводимость данных.

Предварительно смешанный раствор образца необходимо немедленно нанести на планшет для образцов, чтобы обеспечить кристаллизацию образца в контролируемых условиях. После высушивания откройте дверь сушильной камеры.

Затем установите температуру водяного циркулятора на 25 °C. Когда температура планшета с образцами вернется к 25 °C, извлеките его из сушильной камеры. Изучите морфологию образцов с помощью стереомикроскопа при пятикратном увеличении и сделайте снимок в светлом поле.

На данном этапе вставьте планшет с образцами в MALDI-масс-спектрометр. Затем проведите анализ методом масс-спектрометрии визуализации. Выберите характерный масс-пик из списка масс, отображенного в окне результатов, и нажмите «2D», чтобы построить двумерное ионное изображение.

Затем нажмите кнопки регулировки в сплывающем окне, чтобы определить верхний и нижний пределы интенсивности сигнала для повышения разрешения изображения, и нажмите «сохранить изображение» (save a picture). Сравните полученное ионное изображение с ранее полученным изображением в светлом поле, чтобы выделить основной участок образца. Теперь нажмите на пустые области и трещины на ионном изображении, отображаемом в окне результатов, чтобы точно настроить область анализа.

Нажмите кнопку find edge, чтобы определить самый внешний слой ионного изображения. После этого нажмите deduct, чтобы сохранить информацию об ионном обилии внешнего слоя в базе данных и одновременно удалить этот слой с ионного изображения. Повторяйте эти действия до тех пор, пока не будет определен центр ионного изображения, затем отметьте все флажки в списке выходных данных (output data list) и нажмите export для экспорта данных.

Наконец, откройте экспортированные данные в программе для работы с электронными таблицами, чтобы рассчитать среднюю интенсивность ионов в каждом слое и получить информацию о пространственном распределении ионов. На изображениях мальтотриозы, полученных методом светлого поля и MALDI, сигнал ионов натриевой формы при температуре предметного стекла 25 °C сосредоточен в основном по периферии области образца. При снижении температуры до 5 °C сигнал распределяется однородно по всей области образца, что свидетельствует о том, что подготовка образцов при более низкой температуре предметного стекла может значительно перераспределить молекулы и снизить неоднородность.

Изображение ионных фрагментов протонированного брадикинина демонстрирует тенденцию, аналогичную той, что наблюдалась для натриированного мальтотриозы. Статистический анализ показывает, что при температуре планшета с образцами 5 °C неоднородность ионных сигналов снижается на 60–80 % по сравнению с показателями при 25 °C. В случае натриированного мальтотриозы при температуре планшета 25 °C интенсивность сигналов в центре значительно ниже, чем при температуре 5 °C.

Протонированный фрагмент брадикинина демонстрирует меньшую вариативность при снижении температуры планшета с образцами с 25 до 5 градусов Цельсия. При использовании данного метода высушивания необходимо тщательно контролировать и отслеживать температуру и относительную влажность в сушильной камере. После освоения данной методики подготовка образца при правильном выполнении всех этапов может занять 30 минут.

После разработки эта методика открыла исследователям в области MALDI MS путь к количественному анализу образцов в виде высушенных капель. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать гомогенные образцы в виде высушенных капель для анализа методом MALDI MS.