Терруар Концепция толкуется через виноградной ягоды метаболомики и транскриптомика

Общая цель данных экспериментальных процедур заключается в наблюдении различных признаков терруара в метаболоме и транскриптоме ягод винограда сорта Corvina. Описанное здесь исследование включало сбор и анализ образцов на трех стадиях созревания из семи виноградников в трех макрозонах в течение трех вегетационных периодов. Описанные методы позволяют выявить преобладающее влияние условий созревания конкретного винтажа на метаболом ягод.

В спелых ягодах также были выявлены четкие специфические химические признаки, соответствующие трем макрозонам. Сигнатура терруара на уровне макрозоны была определена с помощью подходящих статистических методов, таких как PCA (анализ главных компонентов) и auto BLSDA (автоматизированный дискриминантный анализ на основе двунаправленной ортогональной проекции на латентные структуры), для анализа матриц данных транскриптомики и метаболомики. С другой стороны, различия между отдельными виноградниками выражены менее ярко и требуют применения более сложных и чувствительных статистических подходов.

Начните эксперимент с разработки соответствующего плана отбора проб. Убедитесь, что в плане отбора проб указаны места, время и точная процедура сбора образцов. После сбора 30 гроздей из разных точек вдоль двух рядов виноградника случайным образом выберите по три ягоды из каждой грозди, избегая плодов с видимыми повреждениями или признаками инфекции.

Повторите этот процесс, чтобы получить три независимых пула для каждой стадии созревания. Удалите семена из ягод и немедленно заморозьте перикарпий в жидком азоте. Разотрите все замороженные ягоды из каждого пула с помощью автоматической мельницы-измельчителя.

Разделите каждый порошкообразный образец на две равные части: одну для транскриптомного анализа, другую — для метаболомного анализа. Затем закройте и снимите измельчитель и храните порошки при температуре -80 °C. Подготовьте метаболические экстракты образцов ягод при комнатной температуре в трех объемах метанола, подкисленного 0,1% муравьиной кислотой, в ультразвуковой бане при 40 kHz в течение 15 минут.

Центрифугируйте экстракты при 16,000 ×g в течение 10 минут при температуре four degrees celsius. Разбавьте супернатант двумя объемами деионизированной воды и пропустите через фильтр 0.2 micron. Подготовьте систему высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией с использованием источника электроспрей-ионизации или систему HPLC-ESI-MS, как описано в текстовом протоколе.

Выполните разделение методом ВЭЖХ с использованием линейного градиента растворителей A и B при постоянной скорости потока 0.2 milliliters per minute и объеме вводимой пробы 30 microliters. Снимите масс-спектры, попеременно используя режимы отрицательной и положительной ионизации, с параметрами, указанными в текстовом протоколе. Для обработки данных LCMS проведите процедуры детектирования, выравнивания, заполнения пропусков и фильтрации пиков с помощью подходящего программного обеспечения, такого как открытое ПО M Zeta Mine версии 2.14.

Импортируйте полученные текстовые файлы в электронную таблицу. В результате будет сформирована матрица данных, в которой все обнаруженные метаболиты, идентифицированные по номеру идентификатора, значению отношения массы к заряду и времени удерживания, количественно определены во всех образцах на основе значений площади их пиков. Подготовьте гибридизационную сборку в соответствии со спецификациями четырехпакетного формата, поместив 1.65 micrograms комплементарной РНК, меченной цианином, в конечный объем 41.8 microliters деионизированной воды, свободной от РНКаз.

Добавьте 11 µL 10X блокирующего агента и 2,2 µL 25X буфера для фрагментации. Инкубируйте при 60 °C в течение 30 минут в термостате для фрагментации РНК. По истечении 30 минут немедленно охладите на льду в течение одной минуты.

Наконец, добавьте 55 µL 2X гибридизационного буфера и тщательно перемешайте, используя дозатор. После центрифугирования в течение одной минуты при 15 500 ×g при комнатной температуре немедленно поместите микроцентрифужную пробирку на лед. Чтобы установить специализированный микрочип, поместите предметное стекло с прокладкой этикеткой вверх в основание камеры гибридизации.

Медленно внесите по 100 µL образца для гибридизации в каждую лунку прокладки, распределяя жидкость кончиком пипетки, избегая образования пузырьков. Медленно установите изготовленный на заказ микрочип лицевой стороной вниз, убедившись, что числовой штрихкод направлен вверх. Убедитесь, что сэндвич-пара правильно выровнена.

Наконец, накройте сэндвич из предметных стекол крышкой гибридизационной камеры и затяните зажим камеры вручную. Поверните собранную камеру, чтобы оценить перемещение пузырьков воздуха. Поместите собранную камеру с предметными стеклами в сбалансированный ротиссажер в гибридизационном oven, настроенном на 65 °C.

Установите скорость вращения ротатора на 10 RPM. Продолжайте гибридизацию в течение 17 часов. Для последующей промывки предметных стекол микромассива подготовьте три кюветы для окрашивания стекол и заполните их соответствующими промывочными буферами.

Наполните две кюветы промывочным буфером 1 комнатной температуры, а одну кювету — предварительно подогретым промывочным буфером 2. Разоберите гибридизационную камеру и извлеките «сэндвич». Погрузите «сэндвич» цифровым штрих-кодом предметного стекла микромассива вверх в первую кювету для окрашивания стекол, наполненную промывочным буфером 1 комнатной температуры, и с помощью чистых пинцета отделите прокладку от предметного стекла микромассива.

Быстро перенесите предметное стекло с микрочипом в кассету для стекол и поместите ее во вторую ванночку для окрашивания, заполненную промывочным буфером 1 комнатной температуры. Поместите ванночку на магнитную мешалку и промывайте в течение одной минуты при умеренном перемешивании. Быстро перенесите кассету в третью ванночку, заполненную предварительно нагретым промывочным буфером 2, и промывайте в течение одной минуты при умеренном перемешивании.

Медленно извлеките кассету из лотка для окрашивания слайдов, а затем осторожно выньте слайд из кассеты, стараясь не допустить образования капель. Поместите слайд с микрочипом в подходящий сканер и отсканируйте каждый массив, используя параметры, рекомендованные в руководстве по эксплуатации производителя микрочипов. Для подготовки программного обеспечения для статистического анализа сначала импортируйте данные метаболомики и транскриптомики.

Перейдите в меню File, New Regular Project, New Regular Project, чтобы импортировать полученную матрицу данных. Затем нажмите Edit. Транспонируйте всю матрицу (home) и присвойте соответствующие первичный и вторичный ID. После этого завершите операцию.

Для проведения многомерного статистического анализа перейдите в окно Workset, выберите PCAX в качестве типа модели и нажмите AutoFit. Выберите Scores, а затем Scatter, чтобы отобразить график, показывающий возможную группировку образцов. Изучите график главных компонент (PCA score plot).

Если получена подходящая модель, используйте те же классы образцов для построения модели дискриминантного анализа O2PLS. Чтобы построить две модели дискриминантного анализа O2PLS, используя образцы, классифицированные с помощью MacroZone, назначьте классы, перейдя в окно Home, затем New As, M1 и Observations. Установите требуемые классы.

Затем измените тип модели с PCAX на дискриминантный анализ O2PLS. Нажмите Autofit. Перейдите к выбору M2 в окне проекта (Project), нажмите Scores, а затем Scatter, чтобы увидеть график и положение классов образцов.

Перейдите в Select Data Type и выберите Observations and Loadings. Затем нажмите Add Series и выберите пункты PQ correlation one и PQ correlation two или последующие компоненты, если они доступны. Нажмите правой кнопкой мыши на график, перейдите в Property, выберите Color, а затем выберите By Terms, чтобы различать символы на графике по молекулам и классам.

Перейдите в Layout, Format Plot, Access и или Styles, чтобы изменить график в соответствии с желаемыми характеристиками. Чтобы определить, какие метаболиты характеризуют один или несколько конкретных классов, перейдите в Plot List, а затем в Scatter. Исследовательский анализ всей матрицы данных с помощью PCA показал, что образцы группируются в зависимости от стадии созревания, включая веразон, середину созревания и полную спелость, вдоль первой и второй главных компонент.

Образцы сгруппировались в соответствии с вегетационным периодом вдоль третьей главной компоненты. Дискриминантный анализ O2PLS зрелых ягод позволяет идентифицировать специфические признаки терруара, представляющие три макрозоны: Valpolicella, озеро Гарда и Soave. Графики нагрузок этих моделей представлены в виде PQ-корреляции — корреляции между P (классом образцов) и Q (метаболитами).

На графиках нагрузок красные квадраты обозначают класс образцов или макрозон, а цветные треугольники — отдельные метаболиты. Метаболиты обозначены цветом в соответствии с их химическим классом, а расстояние между метаболитами и образцами отражает их взаимосвязь. Макрозона озера Гарда характеризовалась стильбенами, в то время как Соаве и Вальполичелла характеризовались флавоноидами.

Среди антоцианов пеонидин и его производные были более распространены в макрозоне озера Гарда, в то время как другие антоцианы преобладали в макрозоне Вальполичелла. Кроме того, три-O-глюкозиды антоцианов чаще встречались в макрозоне Вальполичелла, тогда как ацилированные и кумарированные производные были более характерны для макрозоны Соаве. Методы транскриптомики, RA и RNA sig позволяют одновременно отслеживать тысячи транскриптов виноградной лозы.

Недавно был разработан новый специализированный микрочип, содержащий еще большее количество зондов, представляющих дополнительные, недавно обнаруженные роды винограда. Учитывая быстрое устаревание транскриптомных платформ, мы описали альтернативную процедуру с использованием новой платформы, которая содержит больше зондов, чем предыдущая, включая 249 дополнительных предсказанных транскриптов peno для 1392 вновь идентифицированных локусов peno и 179 генов corvina prava. Метаболомный анализ с помощью HPLC-ESI-MS обладает достаточной чувствительностью для одновременного обнаружения большого количества метаболитов.

Способность создать однородную схему отбора проб имеет критическое значение. Выбор одного клона для минимизации генетических различий и многолетний период отбора проб позволили выявить реальные различия между терруарами. Было бы интересно сравнить тот же сорт, выращенный в менее оптимальных зонах, но, к сожалению, такие виноградники оказались недоступны.