Определение и виды Количественное в смесях с помощью масс-спектрометрии MRM пептидов прикладной к мясу аутентификации

Общая цель этого метода заключается в использовании масс-спектрометрии для мониторинга множественных реакций для идентификации и количественного определения веществ, присутствующих в сырых мясных смесях, для использования в качестве инструмента для обнаружения мошенничества с пищевыми продуктами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области целостности пищевых продуктов, такие как подтверждение видов, присутствующих в таких продуктах, как колбасы или гамбургеры. Наш подход основан на масс-спектрометрии белковой составляющей.

Главное преимущество данной методики заключается в том, что она может дать быстрый и количественный результат. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заметили, что белки, известные под одним и тем же названием и разными видами, на самом деле достаточно различны, чтобы дать видовую идентификацию, но достаточно похожи, чтобы их можно было количественно оценить. Термически денатурируйте очищенные референсные миоглобины, нагревая образец в горячем блоке при температуре 95 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Охладите образец в течение примерно 15 минут, пока он не достигнет комнатной температуры. Затем добавьте 30 миллиграмм мочевины для улучшения пищеварения и перемешайте. Добавьте к образцу раствор трипсина в соотношении фермента к субстрату один к 30 по весу.

Затем перемешайте с помощью осторожного вортекса и дайте ему протеолизироваться в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем обессолите образец после протеолиза, сначала разбавив образец водой на один-два объема. Активируйте полимерный картридж с обратной фазой, заполненный 30 миллиграммами материала с обратной фазой, добавив один миллилитр метанола.

Затем уравновесьте картридж, добавив один миллилитр одного процента муравьиной кислоты. Загрузите образец на картридж под действием силы тяжести. Теперь умойтесь одним миллилитром пятипроцентного метанола, содержащего один процент муравьиной кислоты.

Разбавьте пептиды одним миллилитром ацетонитриловой воды в двух миллилитровых микроцентрофугах, предварительно заполненных пятью микролитрами ДМСО. Далее удалите растворитель под вакуумом при температуре 50 градусов Цельсия с помощью центробежного испарителя в течение 120 минут. Затем повторно растворите остаток в 250 микролитрах воды с ацетонитрилом.

Перелейте раствор в флакон с автосамплером малого объема. Найдите последовательности миоглобина для различных встреч в базе данных UniProt. Введите последовательности миоглобина в целевое поле программного обеспечения для прогнозирования пептидов и переходов.

При необходимости наведите указатель мыши на пептид, чтобы отобразить список его фрагментов. После ввода настроек, как описано в текстовом протоколе, нажмите «Экспорт» и выберите «Список переходов», чтобы создать электронную таблицу, содержащую сгенерированные переходы и параметры MRM. Создание высокопроизводительной системы жидкостной хромотографии или ВЭЖХ с бинарным градиентом с автосамплером и колонкой ВЭЖХ с керном C18, соединенной с тройным квадрупольным масс-спектрометром, работающим в режиме положительного электрораспыления с детектированием MRM.

В разделе «Редактирование параметров» программы для сбора данных масс-спектрометрии жидкостной хромотографии выберите тип сканирования MRM и положительную полярность. Введите значения Q1, Q3, time, ID, DP и CE для переходов, созданных в электронной таблице, и сохраните метод получения. После настройки параметров метода, как описано в текстовом протоколе, перейдите к программному обеспечению для сбора данных, нажмите «Получить» и выберите «Уравновесить».

В открывшемся окне выберите необходимый метод сбора данных, чтобы начать выравнивание прибора. Далее поместите флаконы с образцами в штатив в автосамплер. Нажмите «Файл» и выберите «Создать», а затем «Пакет приобретения».

В поле «Имя образца» укажите идентичность каждого из анализируемых образцов. Подробнее о том, как визуализировать полученные данные, см. в текстовом протоколе. Используйте мясо, которое было предварительно заморожено, а затем измельчено в порошок.

Приготовьте различные мясные смеси, взвесив соответствующее количество мяса в пластиковых центрифужных пробирках объемом 15 миллилитров. Добавьте в мясной порошок четыре миллилитра буфера для экстракции. После вортекса в течение 30 секунд экстрагируйте на лабораторном шейкере при комнатной температуре в течение двух часов со скоростью 250 циклов в минуту.

Перелейте два миллилитра экстракта в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и 17 000 G. Перелейте 200 микролитров надосадочной жидкости в двухмиллилитровые центрифужные пробирки. Перед определением концентрации белка в образцах высушите образцы с помощью центробежного испарителя, как описано в текстовом протоколе. Для выполнения протеолиза мясных смесей повторно растворите высушенный остаток в одном миллилитре 25 миллимолярного раствора бикарбоната аммония.

Хорошо перемешайте вортексом и выполните протеолиз, как и раньше. Затем настройте и запустите LCMS аналогичным образом, используя запланированное управление записями сообщений. Отобразите полную хроматограмму в программном обеспечении для просмотра данных.

Отображение извлеченных ионов для каждого набора переходов по очереди. Визуально убедитесь, что каждый кластер содержит необходимое количество колоколообразных пиков на ожидаемое время хранения. Тем самым подтверждая существование выбранного пептида.

Затем дважды щелкните Мастер количественного определения на панели навигации. В окне "Выбор образцов" создайте набор количественных показателей, выбрав один файл данных. Затем выберите один или несколько доступных образцов.

Нажмите кнопку Далее, чтобы отобразить поле выбора параметров и запроса. Оставьте настройки по умолчанию и нажмите Далее, чтобы отобразить Выбрать метод. В раскрывающемся списке Метод выберите файл метода интеграции и, наконец, нажмите Готово.

Сохраните таблицу результатов, экспортируйте ее в виде текстового файла и откройте ее в электронной таблице, чтобы просмотреть данные, как описано в текстовом протоколе. На этом рисунке показаны наиболее интенсивные переходы MRM для лошади, полученные из однопроцентной весовой массы смеси с говядиной. Напротив, красная линия показывает переход от говядины, когда нет лошади.

Это график измеренного и подготовленного количества лошади в говядине, выраженный в соотношениях. На графике наглядно показано, как этот метод может быть использован для проведения количественных измерений. После освоения и использования пакетной обработки производительность по этому методу может достигать до 20 образцов за 24 часа.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выборе подходящего белка для анализа экстракции. Миоглобин является хорошим кандидатом для изучения видов красного мяса, потому что он распространен, растворим в воде и термостабилен. Эта процедура может быть расширена для включения в нее других видов, подлежащих одновременной идентификации и количественной оценке.

Максимальное число ограничено только скоростью масс-спектрометрического сканирования. Этот метод открывает исследователям путь к использованию пептоотпечатков пальцев в таких областях, как защита потребителей и бренда.