Визуальный колориметрический Обнаружение Multi-нуклеотидных полиморфизмов на Manipulation платформы Пневматический дроплета

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы совместить простой метод визуального обнаружения многонуклеотидных полиморфизмов с платформой для пневматических манипуляций с каплями. Платформа для обнаружения ДНК находится на открытой поверхности и проста для использования биохимическими исследователями. Мы исследовали простой инструмент для многократного выявления генетических мутаций и генетических заболеваний.

Он обладает большим потенциалом, помогая нам понять, как генетическая изменчивость приводит к заболеваниям. Мы объединили два новых и простых метода. Многонуклеотидный полиморфизм может быть обнаружен на пневматической платформе для манипуляций с каплями невооруженным глазом и без использования дополнительного инструмента.

Метод выявления многонуклеотидного полиморфизма будет продемонстрирован Цзы-Мин Вангом, постдоктором нашей группы. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 100 микромолярный раствор зондовой ДНК, как указано в текстовом протоколе. Затем добавьте ДНК зонда к одному наружному диаметру на миллилитр раствора наночастиц золота.

Доведите конечную концентрацию SDS до 0,01%, а PBS до 0,01 моляра. Дайте раствору поинкубироваться в течение 20 минут. Далее увеличивают концентрацию хлорида натрия до 0,05 моляра, добавляя раствор двух моляров натрия хлорида и 0,01 моляра ПБС.

Поддерживайте концентрацию SDS на уровне 0,01% и дайте раствору инкубироваться в течение 20 минут. Увеличивайте концентрацию хлорида натрия с шагом 0,1 моляра с интервалом в 20 минут до достижения конечной концентрации в один моляр. Инкубируйте раствор при температуре 23 градуса Цельсия в течение ночи на ротаторе.

После того, как образцы ДНК и наночастицы золота станут конъюгированными, центрифугируйте раствор при 7000 g в течение 30 секунд. Удалите надосадочную жидкость. Затем приготовьте раствор зонда из наночастиц золота с концентрацией 25 наномоляров, повторно суспендируя гранулу в деионизированной воде.

Подготовьте целевые образцы ДНК в соответствии с текстовым протоколом. Добавьте шесть микролитров раствора зонда наночастиц золота в каждый образец ДНК с хлоридом натрия. С помощью вихревого миксера встряхивайте каждый раствор образца в течение пяти минут при температуре 23 градуса Цельсия.

Затем добавьте шесть микролитров 400 миллимолярного гидроксильного амина и шесть микролитров 25,4 миллимолярной хлорауриновой кислоты в каждый раствор образца ДНК. Отложите эти образцы в сторону, так как в течение следующего часа будет происходить устойчивое изменение окраски. размер, зависящие от формы оптические свойства наночастицы, количество типичных для образца фрагментов ДНК могут быть различимы на глаз.

Чтобы начать изготовление платформы для манипуляций с каплями, используйте станок с числовым программным управлением, оснащенный сверлом диаметром 0,5 мм, для производства мастер-форм на основе ПММА с микроструктурой. Для сверла используйте скорость подачи семь миллиметров в секунду и скорость вращения 26 000 об/мин, а также осмотрите пресс-формы после сверления. Используйте воздуходувку и деионизированную воду для очистки поверхности мастер-форм и удаления остатков ПММА.

После этого приготовьте смесь основы PDMS и отвердителя в соотношении 10 к одному. Дегазируйте смесь в эксикаторе до тех пор, пока не будут удалены все пузырьки воздуха. Затем залейте смесь PDMS в форму для мастер-форм.

Выпекать в течение трех часов при температуре 60 градусов Цельсия для получения инверсных микроструктур в воздушных камерах и воздушных каналах. После завершения выпечки снимите слой PDMS с формы и проделайте в нем отверстия для приточных отверстий для всасывания воздуха. Используйте систему кислородной плазменной обработки для очистки мембраны PDMS и слоя PDMS.

После обработки соедините мембрану PDMS и слой PDMS, а затем проделайте отверстия в этой сопряженной структуре. Затем соедините PDMS и стеклянную подложку вместе с помощью горячей пластины при температуре 90 градусов Цельсия в течение 10 минут. После того, как слои склеены вместе, поместите композитную пластину в станок для лазерной резки PDMS мембраной вверх.

Импортируйте файл dwg для определения супергидрофобной области, и обратите внимание, что она будет непосредственно выгравирована на мембране PDMS. Очистите только что выгравированную супергидрофобную поверхность деионизированной водой. Это смоет любые обугленные остатки.

После очистки поверхности подключите впускное отверстие для всасывания воздуха и вакуумный насос через электромагнитный клапан. Затем подключите электромагнитный клапан к компьютеру для управления им с помощью цифрового USB-модуля ввода-вывода. После того, как платформа для пневматических манипуляций с каплями будет настроена, добавьте 10 микролитров 0,5 микромолярной целевой ДНК в супергидрофобную область.

Затем добавьте 10 микролитров свежегибридизованного раствора 25 наномолярного зонда золота рядом с целевой каплей ДНК. Используйте простую программу для управления всасыванием воздуха к платформе через электромагнитный клапан. Установите давление на минус 80 килопаскалей, а частоту движения на пять герц.

Обеспечивает всасывание вдоль путей вибрации капли, вызывая их столкновение и слияние. Затем смешайте слитую каплю, манипулируя всасыванием, чтобы катать образец в течение трех минут. Добавьте два микролитра 400 миллимоларгидроксиламина и два микролитра 25,4 миллимоларной хлорауриновой кислоты в супергидрофобную область платформы для манипуляций с пневматическими каплями.

Управляйте всасыванием так, чтобы капли сталкивались и сливались. Затем смешайте слитую каплю, катая ее в течение одной минуты. Наблюдайте за цветом конечной капли невооруженным глазом.

В этом исследовании многонуклеотидные полиморфизмы обнаруживаются колорометрическим методом с использованием ДНК-гибридизации, опосредованного ростом зондов наночастиц золота. Здесь образцы ДНК обладают различным сродством к ДНК зонда, что вызывает различия в росте наночастиц золота, наблюдаемые как изменение цвета. Образец ДНК с тремя парами оснований имеет меньшую гибридизацию, чем полностью комплементарная ДНК, что можно увидеть в виде заметных различий в цвете, особенно при более высоких концентрациях.

Несовпадающая ДНК с шестью основаниями имеет слабое сродство к гибридизации к зонду, и поэтому размер роста наночастиц золота был небольшим. Показано, что этот колорометрический анализ повторяется при обработке образцов с помощью пневматической всасывающей платформы, поскольку результаты несоответствия ДНК легко наблюдаются невооруженным глазом. После освоения вся процедура занимает менее пяти минут с момента добавления образца и реагента до их получения, что намного быстрее, чем при традиционном методе.

Итог в каждой операции составляет всего 10 микролитров, что значительно меньше, чем требуется в большой системе. После этой процедуры, как только будет подтверждено, что изменение последовательности пространства фрагмента ДНК ответственно за конкретное заболевание. Специально разработанный продукт может быть использован для получения ряда несоответствий ДНК образца.

Платформа для пневматической манипуляции с каплями более биосовместима по сравнению с другими методами, такими как оптическое взвешивание, электрофлуоресценция красителя, электроутяжеление и капиллярная активация Shoomoo. Предложенный метод детектирования многонуклеотидного полиморфизма проводился на пневматической платформе для манипуляций с каплями, что позволяет напрямую загружать и собирать образцы и реагенты с помощью пипетки. После своего развития этот метод имеет высокий потенциал для скрининга ДНК и других химических и биоматических применений.