Конструкция и использование низкой стоимости, Автоматизированная Morbidostat для адаптивной эволюции бактерий в Антибиотик Выбор лекарственных средств

Общая цель данного эксперимента — охарактеризовать эволюционный путь развития антибиотикорезистентности с помощью морбидостата, который непрерывно контролирует рост бактерий и динамически корректирует концентрацию антибиотика по мере приобретения бактериями устойчивости к препарату. Основным преимуществом данной методики является то, что установка состоит из недорогих и легкодоступных электронных компонентов и может быть легко перенастроена для конкретных целей. Процедуры продемонстрируют По Ченг Лю и И Тай Ли, аспиранты моей лаборатории.

Для сборки морбидостата начните с того, что с помощью иглы калибра 18 проделайте три отверстия в крышке флакона для культивирования. Отрежьте три кусочка полиэтиленовой трубки длиной примерно семь сантиметров и вставьте их в отверстия в крышке. Используйте клейкую ленту, чтобы обернуть край крышки, которая будет служить формой для смеси полидиметилсилоксана (PDMS).

Затем добавьте 5 г компонента А и 0,5 г компонента B PDMS в пластиковый контейнер объемом 150 мл и перемешайте смесь вручную с помощью зубочистки. Перенесите смесь в шприц объемом 10 мл. Затем с помощью шприца нанесите смесь PDMS на колпачок.

Прокалите всю колпачковую часть при 70 °C в течение восьми часов для отверждения PDMS. Затем с помощью паяльника припаяйте анод светодиода к проводу калибра 24 gauge, а катод светодиода — к углеродному резистору. После этого припаяйте углеродный резистор на 680 Ohm к проводу калибра 24 gauge.

Используйте изоленту, чтобы изолировать соединение проводов. Припаяйте коллектор фотодетектора к проводу калибра 24 gauge, а эмиттер фотодетектора — к угольному резистору сопротивлением 100 Ohm. Затем снова используйте изоленту, чтобы изолировать соединение проводов.

Поместите светоизлучающий диод в держатель для культурального флакона. Следуя представленной здесь схеме электрической цепи, подключите светоизлучающий диод и используйте источник питания с напряжением 5 V для его питания. Убедитесь в работоспособности светодиода с помощью цифровой камеры, способной обнаруживать ИК-излучение. Теперь поместите фотодетектор в держатель для культурального флакона.

Затем, следуя схеме, подключите фотодетектор и используйте блок питания на 5 В для его питания. Подключите провод к обеим сторонам резисторов фотодетектора, чтобы измерить напряжение на плате электронного управления. Приклейте магнит к валу вентилятора охлаждения, который выполняет функцию устройства магнитной мешалки.

Поскольку блок магнитного перемешивания состоит из магнита и охлаждающего вентилятора, крайне важно совместить полку вентилятора с культуральным флаконом. Также расстояние между культуральным флаконом и магнитом имеет критическое значение для обеспечения стабильной работы. Соедините каждую полиэтиленовую трубку культурального флакона с соответствующей силиконовой трубкой микронасосов, флаконов со средой и флакона для отходов.

Включите насос на один час и измерьте общий объем жидкости, перекачанной из флакона со средой в культуральный флакон, чтобы определить скорость перекачки. Типичная скорость перекачки должна составлять примерно 4 мл/ч, что соответствует скорости разбавления D = 0,33 ч⁻¹ при рабочем объеме культурального флакона 12 мл. После завершения сборки поместите всю установку в инкубатор-шейкер среднего размера.

Для предварительного тестирования морбидостата установите напряжение питания охлаждающего вентилятора на пять вольт, чтобы запустить его двигатель и проверить работу магнитного перемешивающего элемента. После подготовки серии образцов E-coli и построения калибровочной кривой согласно текстовому протоколу, подготовьте флакон с культурой, используя три отрезка сверххимически стойкой трубки Tygon длиной семь сантиметров с внутренним диаметром 1/32 дюйма и внешним диаметром 3/32 дюйма для создания впускных отверстий устройства. Приготовьте минимальную среду M9 с 0,2% глюкозы и среду M9, содержащую препарат триметоприм (TMP).

Затем стерилизуйте среду, флакон со средой, флакон со средой с препаратом, флакон для отходов и культуральную пробирку в автоклаве при 121 °C. В первый день эксперимента разморозьте один миллилитр замороженных клеток дикого типа E-coli MG1655 при комнатной температуре в течение пяти минут и перенесите 120 µL клеток в культуральную пробирку, содержащую примерно 12 mL питательной среды M9. Включите шейкер-инкубатор и установите температуру 30 °C без перемешивания.

Запустите работу морбидостата, включив микронасос, магнитную мешалку и систему измерения оптической плотности. Примерно через 23 часа остановите микронасос, отключив напряжение питания, и извлеките флакон с культурой. Добавьте в флакон с культурой 15% глицерина и заморозьте образцы при -80 °C для хранения.

Переход на новый флакон с культурой в начале каждого из этих экспериментов также важен для предотвращения образования биотина. В противном случае образование биотина может произойти в течение двух или трех дней. После размораживания ежедневного замороженного образца при комнатной температуре в течение пяти минут инокулируйте новую пробирку со свежей средой M9.

Поместите образец в шейкер-инкубатор при 37 °C на ночь. На следующий день разведите микробный образец в десять раз с помощью среды M9 и загрузите его в микрофлюидное устройство, создав давление 5 PSI в контейнере с микробным образцом. Затем загрузите в чип среду, содержащую TMP, создав давление 5 PSI в контейнере со средой M9 с TMP.

Осуществите смешивание микроба и препарата, задействовав микромеханический клапан между двумя камерами на микрофлюидном чипе в течение 15 минут. В завершение поместите микрофлюидный чип в микроскопный инкубатор, установленный на инвертированном микроскопе. С помощью CCD-камеры выполняйте захват изображений клеток в камере роста каждый час на протяжении восьми часов.

Рассчитайте данные о количестве клеток в соответствии с текстовым протоколом. Стандартные операции морбидостата, включая экспериментальную эволюцию, тест на чувствительность к антибиотикам и проверку морфологии клеток, были валидированы с использованием культуры E-coli MG1655, подвергнутой воздействию антибиотика TMP, который вызывает характерное ступенчатое повышение лекарственной устойчивости с мутациями, сосредоточенными вокруг гена дигидрофолатредуктазы (DHFR). Ожидается, что каждый день микроорганизм будет расти выше заранее установленного порога оптической плотности и инициировать впрыскивание препарата, как показано здесь.

Ожидается, что введение препарата подавит рост и, как следствие, снизит оптическую плотность. На данном графике показано изменение во времени резистентности к антибиотику в эксперименте по определению IC50. За период около 12 дней резистентность к препарату увеличилась примерно в 1500 раз, достигнув 1, 000 micrograms per milliliter.

Результаты согласуются с предыдущими данными. Точечные мутации DHFR в мутанте последнего дня были определены с помощью секвенирования по Сэнгеру и приведены в данной таблице. Приобретение лекарственной устойчивости при наличии множественных мутаций доказывает эффективность использования Morbidostat.

Поскольку селекция на агарных пластинах с лекарственным средством обычно приводит к возникновению лишь одной мутации. На этом рисунке представлены кривые роста на чипе при различных концентрациях TMP. Образцы мутантов демонстрируют значительное повышение устойчивости к антибиотикам.

После разработки этот метод позволил исследователям изучать резистентность к антибиотикам в условиях реальной контрольной лаборатории. После выполнения данной процедуры можно провести другие измерения, например, микрофлюидный анализ единичных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как изменение морфологии под воздействием антибиотиков. После освоения данное устройство можно легко перенастроить для любых экспериментов с бактериальными культурами, например, для культивирования определенного вида бактерий или повышения уровня толерантности бактериального штамма.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изучать приобретение устойчивости к антибиотикам в реальном контролируемом адаптивном лабораторном эволюционном эксперименте. Не забудьте обращаться с бактериями, устойчивыми к препаратам, в соответствии с правилами биобезопасности при работе с микробиологическими культурами. Для проведения эксперимента, связанного с базовым обучением бактерий, может потребоваться специальное разрешение.