Инфекции мочевыводящих путей в небольшой животной модели: трансуретральная катетеризация мужские и женские мышей

Общая цель этого экспериментального подхода заключается в изучении иммунного ответа на инфекцию мочевыводящих путей и предотвращении прямого сравнения между самцами и самками животных. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы иммунологии слизистых оболочек, связанные с тем, как мужчины и женщины реагируют на инфекцию мочевыводящих путей. Основное преимущество заключается в том, что инфекция устанавливается через естественный корень.

Идея этого метода пришла нам в голову после того, как мы заметили, как часто утверждается, что установка мочевого пузыря у самцов мышей невозможна. Хотя этот метод дает представление об инфекции мочевыводящих путей, он также может быть применен к исследованиям других заболеваний, таких как рак мочевого пузыря. Для начала подготовьте одну педиатрическую канюлю для внутривенного доступа для каждой группы инфицированных мышей.

С помощью встроенного пружинного механизма извлеките из каждой канюли иглу в соответствии с инструкциями производителя. Выбросьте иглы, сохранив только пластиковую внутривенную канюлю. Стерилизуйте катетеры в колпаке с ламинарным потоком в течение одного цикла ультрафиолета продолжительностью примерно от 25 до 30 минут.

После ночного культивирования уропатогенной кишечной палочки, или UPEC, в соответствии с текстовым протоколом, вращают бактериальную суспензию в настольной микроцентрифуге в 17 000 раз g в течение одной минуты и повторно суспендируют полученную бактериальную гранулу в соотношении два раза по 10 до восьмого КОЕ на миллилитр в PBS. Последовательно разведите аликвоту суспензии и положите на LB-агар антибиотики, если это необходимо, чтобы определить точный инокулюм для каждой инфекции. Наберите бактериальный инокулят в одномиллилитровый шприц и прикрепите катетер к концу шприца.

Постучайте по шприцу, чтобы удалить воздух, и нажмите на поршень, чтобы заполнить мертвое воздушное пространство в катетере перед началом закапывания. После обезболивания самки мыши в соответствии с утвержденным протоколом поместите животное в положение лежа на спине, и приложите среднее давление к нижней части живота, чтобы опорожнить мочевой пузырь от мочи. Полные пузыри ощущаются как горошины под кожей, между гребнями подвздошной кости.

Когда мочевой пузырь опорожнен, используя недоминирующую руку, поместите большой палец на хвост и палец той же руки на брюшную полость мыши и слегка надавите в противоположных направлениях, чтобы надежно удерживать мышь на месте. Далее поместите кончик катетера перпендикулярно мыши у отверстия уретры, затем с легким нажимом вставьте катетер в уретру до тех пор, пока ступица не встретится с отверстием уретры, одновременно опуская шприц так, чтобы он был параллелен рабочей поверхности. Как только катетер будет установлен, используйте палец недоминирующей руки, которая лежит на брюшной полости мыши, чтобы очень осторожно потянуть кожу живота к голове мыши.

Учтите, что уретральное отверстие не будет двигаться. Однако, если катетеры находятся во влагалище, ткань будет перемещаться вверх и удаляться от катетера. Приложив ступицу катетера к уретральному отверстию, медленно введите 15 микролитров бактериального посева.

Медленная скорость установки сводит к минимуму пузырно-мочеточниковый рефлюкс в почку. Медленно извлеките катетер, чтобы предотвратить подтекание. Затем поместите животное в клетку в положение лежа на спине.

Чтобы сделать прививку самцам мышей, поместите два щипца большого пальца краниально и каудально к наружным половым органам мыши. Втяните препуций, чтобы полностью обнажить пенис железы. Затем, как только пенис будет расположен снаружи, отпустите щипцы для большого пальца.

Переместите щипцы так, чтобы стабилизировать выступающий пенис перпендикулярно животному, удерживая орган мягко, но туго. Затем через небольшое отверстие в кончике уретрального прохода осторожно введите катетер и аккуратно введите его в половой член с помощью щипцов для мягкого поддержания напряжения. Как только ступица катетеров встретится с кончиком полового члена, очень медленно дозируйте 50 микролитров инокулюма, сохраняя при этом положение полового члена.

Обратите внимание на качество инстилляции в соответствии с заранее определенной оценкой качества инстилляции, такой как показанная здесь. Медленно втяните катетер в течение пяти секунд, чтобы предотвратить утечку инокулюма. Поместите мышь в клетку в положение лежа на спине.

Животное должно начать восстанавливаться через 30-45 минут после введения анестетика. После умерщвления мышей в соответствии с утвержденным протоколом используйте 70% Epinal для тщательного увлажнения брюшной полости, чтобы свести к минимуму загрязнение шерстью. С помощью ножниц сделайте двухсантиметровый разрез поперек нижней трети живота мыши, и асептически удалите мочевой пузырь и любые другие желаемые органы.

Переложите органы в пятимиллилитровые полипропиленовые пробирки с защелкивающимися крышками, содержащие один миллилитр стерильного PBS, и держите все образцы на льду. С помощью ручного гомогенизатора гомогенизируйте органы до тех пор, пока практически не останется твердой ткани. Откажитесь от блестящей, бежево-белой жировой ткани, которая плохо гомогенизируется.

Затем используйте Epinal, а затем PBS для промывания гомогенизатора между каждой экспериментальной группой или группой органов. После приготовления серийных разведений гомогенизированной органной суспензии, планшетные разведения на агаровых планшетах LB, с антибиотиками, когда это необходимо, инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение ночи. Чтобы провести проточную цитометрию на ткани мочевого пузыря, после изоляции мочевого пузыря, как было показано ранее в этом видео, используйте ножницы, чтобы хорошо измельчить ткань.

Добавьте по одному измельченному пузырю в каждую трубку, содержащую буфер для пищеварения. Затем встряхните трубку, чтобы промыть измельченную ткань в буфере для пищеварения, и держите ее на льду, пока все пузыри не будут рассечены и измельчены. Инкубируйте измельченные пузыри при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60-75 минут, энергично встряхивая рукой в течение пяти секунд, каждые 15 минут.

Когда ткань имеет стекловидный прозрачный вид, напоминающий влажную папиросную бумагу, пищеварение завершено. Инактивируйте ферменты пищеварения, добавив два-три миллилитра ледяного проточного цитометрического буфера, и аккуратно перемешайте. Затем поместите трубки на лед.

Чтобы обеспечить одноклеточную суспензию и удалить любую соединительную ткань, пропустите содержимое пробирки через фильтр 100 микрометров, помещенный в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Затем концом поршня шприца аккуратно продавите любую оставшуюся ткань через фильтр. Промойте фильтр дополнительными двумя миллилитрами буфера для проточной цитометрии и держите образцы на льду.

Промывают образцы центрифугированием при температуре 200 g и четырех градусах Цельсия в течение семи минут. Суспендируйте гранулы в 100 микролитрах буфера для проточной цитометрии, содержащем Fc-блок, разбавленном до пяти микрограммов на миллилитр, и перенесите в круглую нижнюю пластину 96 лунок. Через 10-15 минут добавьте по 100 микролитров желаемого коктейля антител в каждый образец.

Затем инкубируйте образцы на защищенном от света льду в течение 30-45 минут. Промойте образцы центрифугированием при 200 умноженных на г и четырех градусах Цельсия в течение семи минут. Наконец, ресуспендируйте клеточные гранулы в 200 микролитрах буфера для проточной цитометрии и пропустите образцы через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 40 микрометров на пятимиллилитровой полистирольной трубке непосредственно перед получением на проточном цитометре.

На этом рисунке представлены репрезентативные данные о мышах, инфицированных в течение 24 часов. Бактериальная нагрузка была эквивалентной между самцами и самками мышей через 24 часа после заражения. Чтобы определить, повлияла ли потеря посевного материала во время инфекции на развитие инфекции, каждая инстилляция была оценена по шкале от одного до пяти, где один из них является наиболее оптимальным.

Бактериальная колонизация определялась через 24 часа после заражения. Не было обнаружено статистически значимых различий между КОЕ, полученными от животных с различными баллами инстилляции, оцененными с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса, сравнивая средний ранг каждого столбца со средним рангом каждого другого столбца и корректируя множественные сравнения с использованием теста Данна. Можно сделать вывод, что неоптимальные инстилляции, приводящие к существенной утечке бактериального инокулята во время инфекции, не оказывают существенного влияния на бактериальную колонизацию через 24 часа.

Важно отметить, что частота неоптимальных прикапываний будет уменьшаться с практикой. Наконец, в то время как количество CD45-положительных иммунных клеток, присутствующих у наивных животных, не отличалось между самками и самцами мышей, наблюдалось статистически значимое увеличение инфильтрации в мочевые пузыри инфицированных самок мышей. При попытке катетеризации важно использовать медленные, мягкие движения.

С его развитием этот метод помог нам изучить половые различия в иммунитете мочевого пузыря самцов и самок животных.