Захват и Выпуск Жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток из крови

Общая цель этого метода заключается в эффективном захвате жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток или ЦОК из цельной крови. Эти ЦОК могут быть помещены в культуру или использоваться для последующих анализов, для которых требуются нефиксированные образцы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования.

Он также может быть использован для отслеживания прогрессирования заболевания, ответа на терапию и оценки риска рецидива. Преимуществом этой методики является возможность выполнять безмаркерный захват жизнеспособных ЦОК из любой солидной опухоли, оставаясь при этом независимым от экспрессии биомаркеров. Сначала у нас возникла идея высвобождения ЦОК из фильтра, потому что мы хотели проводить анализ РНК и культивирование ЦОК, а не культивировать их на месте на фильтре.

Чтобы начать эксперимент, взвесьте достаточно PIPAAm, чтобы приготовить 10% веса на объем раствора в 15-миллилитровой пробирке, содержащей бутанол. Делайте трубку вихревыми до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Затем разрежьте пластиковые предметные стекла микроскопа на квадраты размером примерно 12 на 12 миллиметров с помощью ножниц.

Затем с помощью острых ножниц с прямыми краями разрежьте пластину микрофильтра со щелевой порой на квадраты размером восемь на восемь миллиметров и поместите эти кусочки прямо на пластиковые квадраты. С помощью полиимидной пленочной ленты закрепите отрезанные фильтры на пластиковых квадратах, только по краю и углу фильтра таким образом, чтобы как минимум семь на семь миллиметров площадь фильтра не была покрыта лентой. Поместите микрофильтр, закрепленный на пластиковом квадрате, на вакуумный патрон машины для нанесения мер.

Запрограммируйте отжимную машину по следующему рецепту. Затем с помощью стандартной пластиковой переводной пипетки нанесите достаточное количество раствора PIPAAm весом 10% на объем, чтобы полностью покрыть поверхность микрофильтра, и запустите отжимную установку. После того, как покрытие будет завершено, снимите микрофильтр с покрытием PIPAAm с вращающегося устройства для нанесения покрытий и оставьте фильтр прикрепленным к пластиковому квадрату на время хранения.

Перейдите к фильтрующей кассете и регидратируйте микрофильтр с покрытием PIPAAm при комнатной температуре, поместив микрофильтр в чашку Петри. Добавляйте 1X PBS до полного погружения микрофильтра. После этапа гидратации освободите фильтр от пластикового квадрата, отклеив или отрезав полиимидную пленочную ленту от фильтра.

Затем соберите микрофильтр в фильтрационную кассету, поместив микрофильтр между верхней и нижней акриловой частью вдоль деталей PDMS, которые действуют как прокладка. Затем зажмите акриловую кассету зажимами, чтобы закрепить фильтр, чтобы обеспечить плотное прилегание. Нагрейте три миллилитра среды для клеточной культуры McCoy's до 37 градусов по Цельсию.

Добавьте 7,5 миллилитров сбалансированного солевого раствора Хэнка или HBSS к 7,5 миллилитров образца крови и аспирируйте эту разбавленную кровь в 25-миллилитровый шприц. Определив верхнюю часть кассеты, зацепите фильтрующую кассету со шприцем и поместите ее на шприцевой насос. Установите шприцевой насос на скорость потока 75 миллилитров в час.

Поместите на дно 50-миллилитровую трубку, чтобы собрать поток и запустить насос. После завершения фильтрации отсоедините фильтрационную кассету, обращая внимание на то, с какой стороны элементы находятся в поверхности, покрытой PIPAAm. Отсадите один миллилитр теплой питательной среды в новый шприц.

Снова определите верхнюю часть кассеты, а затем снова зацепите фильтрующую кассету со шприцем, содержащим среду, и зацепите нижний конец кассеты так, чтобы поверхность фильтра с покрытием PIPAAm была обращена в сторону от шприца. Затем поместите шприц обратно на шприцевой насос и держите шестилуночную пластину прямо под фильтрующей кассетой. Установите расход и запустите насос.

Пропустите всю среду через фильтр и соберите поток в чашке Петри. Подождите, пока пройдет вся среда, затем остановите насос и извлеките шприц и фильтрационную кассету из насоса. Затем отсоедините фильтрующую кассету от шприца и откройте ее, чтобы извлечь фильтр из кассеты.

Поместите фильтр поверхностью PIPAAm вниз в ту же чашку Петри, которая используется для сбора обратного потока при высвобождении клеток из пор. Добавьте оставшуюся теплую среду и поместите чашку Петри в инкубатор для культур, установленный при температуре 37 градусов Цельсия. После извлечения фильтра из кассеты крайне важно поместить его в пластину элементами вниз и, при необходимости, осторожно встряхнуть его в фильтрующем материале, чтобы убедиться, что элементы отделены от фильтра.

После 24 часов в культуре осторожно извлеките микрофильтр с помощью щипцов и выбросьте фильтр. Аккуратно ресуспендируйте эритроциты и мононуклеарные клетки периферической крови или PBMC с помощью пипетки объемом 1000 микролитров. Крайне важно быть предельно осторожным при ресуспендиации эритроцитов и PBMC, чтобы избежать пипетирования ЦОК.

Осторожно удалите всю среду, содержащую ресуспендированные эритроциты и PBMC, оставив прикрепленные раковые клетки, и замените клетки свежей средой, предварительно нагретой до 37 градусов Цельсия. Проведите оценку жизнеспособности CTC. Используя здоровую донорскую кровь, приправленную культивируемыми раковыми клетками, термочувствительный метод высвобождения жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток или ЦОК, достиг эффективности захвата, высвобождения и извлечения 94%82% и 77% соответственно.

Эффективность выпуска и извлечения фильтров без покрытия была значительно ниже. Анализ живых мертвецов был проведен для оценки жизнеспособности клеток до всплеска в кровь и после выброса. Клетки оставались жизнеспособными после высвобождения и быстро размножались в культуре.

Клетки СКБр-3 извлекали из крови с помощью щелевого фильтра с покрытием PIPAAm и помещали на 48-луночный планшет. Через 16 часов в культуре опухолевые клетки прилипают к культуральной пластине вместе с гипотоническими эритроцитами и лейкоцитами, которые оседают на дне пластины. Неадгезивные клетки после промывки удаляли только оставаясь на пластине с адгезивными опухолевыми клетками.

Одни и те же фильтры могут быть использованы для захвата фиксированных клеток, как для перечисления, так и для молекулярной характеристики ЦОК для отслеживания прогрессирования рака и лучшего лечения рака. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области ЦОК, позволяющим функционально охарактеризовать эти клетки для изучения будущих мишеней лекарств, делая при этом шаг в сторону персонализированной медицины.