Отложенный роста Анализ ингибирования для количественной оценки влияния бактерий, полученных Противомикробные по конкуренции

Общая цель данного протокола заключается в количественном и качественном изучении конкуренции одного бактериального изолята по отношению к другому. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в рамках исследований конкурентного исключения внутри бактериальных сообществ. Основным преимуществом данной методики является то, что она отражает реальные процессы, происходящие в бактериальном сообществе.

Для успешного вторжения инвазивные изоляты должны быть способны выживать в условиях ингибирующего воздействия уже установившихся изолятов. Процедуру продемонстрирует Эмма Кранк, аспирантка факультета госпитальной биологии. Для начала приготовьте агар с мозгово-сердечным настоем (BHI) в соответствии с инструкциями производителя.

Автоклавируйте агар при 121 °C под давлением 15 psi в течение 20 минут для стерилизации. Разлейте стерильный агар BHI аликвотами по 15 мл в стерильные чашки Петри и дайте ему застыть. Приготовьте бульон BHI в соответствии с инструкциями производителя и перенесите аликвоты по 10 мл в стеклянные универсальные флаконы объемом 28 мл.

Затем автоклавируйте бульон BHI в течение 20 минут. Для подготовки флаконов испарителя начните с их разборки. Распылите 5% поверхностно-активный очищающий агент через испаритель, чтобы удалить внутренние загрязнения.

Затем выдержите флакон испарителя, крышку и сам испаритель в чистящем средстве в течение ночи. На следующий день высушите испаритель, крышку и флаконы под стерильным ламинарным потоком воздуха. После этого заполните флаконы 70% ethanol.

После этого снова прикрепите распылитель и распылите небольшое количество этанола. Закройте распылитель крышкой и храните его с этанолом внутри до начала использования. Перед использованием асептически промойте флакон стерильным бульоном BHI, а затем распылите бульон через распылитель.

Для подготовки ночных бактериальных культур посейте штрихом штаммы конкурента и ингибитора на стерильный чашку с агаром BHI и инкубируйте при 37 °C в аэробных условиях примерно в течение 18 часов. В универсальный флакон объемом 28 мл внесите одну колонию необходимого бактериального штамма-конкурента в 10 мл стерильного бульона BHI. Инкубируйте культуру в универсальном орбитальном шейкере при 37 °C и 250 RPM в течение ночи.

На следующий день убедитесь, что чашки с агаром полностью высохли и на крышках нет конденсата, чтобы предотвратить растекание инокулята по поверхности среды. Пипетируйте 25 µL ночной культуры в центр чашек с агаром, стараясь не нажимать поршень пипетки до самого конца, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которые могут разбрызгать культуру по агару. Дайте культуре высохнуть при комнатной температуре, чтобы ограничить ее распространение.

Затем инкубируйте чашки с агаром при 37 °C в аэробных условиях в течение ночи. После получения ночной культуры, работая в шкафу биологической безопасности второго уровня, застеленном абсорбирующей бумагой, разведите культуру в бульоне BHI в десять раз, чтобы получить примерно 4 × 10⁶ КОЕ на мл. Затем перелейте разведенную культуру в стерильный пластиковый флакон-распылитель для парфюмерии.

Для проведения анализа отсроченного подавления роста распылите культуру из каждого флакона-распылителя, чтобы убедиться, что культура загружена в распылительный механизм перед нанесением на агар. С расстояния примерно 15 сантиметров над агаром распылите около 250 microliters разведенной культуры по всей поверхности агара. Инкубируйте чашки при 37 degrees Celsius в аэробных условиях в течение ночи.

Для интерпретации отложенного ингибирования роста измерьте в миллиметрах зону ингибирования роста распыленного штамма-конкурента, вычтя диаметр центрального пятна штамма-продуцента ингибитора. В завершение зафиксируйте показатель прозрачности зон ингибирования в соответствии с текстовым протоколом. Как показано на этом рисунке, результаты анализа должны быть заметны в виде различий в слое штамма-конкурента рядом с нанесенным в центре штаммом-продуцентом ингибитора.

Различия могут проявляться в виде полного ингибирования, частичного ингибирования, отсутствия ингибирования или положительной ассоциации. На данном графике сравниваются зоны ингибирования между продуцирующими ингибитор изолятами, что может быть следствием количества вырабатываемого противомикробного агента, способности ингибитора диффундировать через среду, типа вырабатываемого ингибитора или уровня резистентности конкурирующего штамма к ингибиторам. Этот пример показывает, что если тестовая культура конкурента слишком разведена, зона ингибирования будет казаться больше, а ее край — менее четко выраженным, чем обычно.

Если пятно штамма-продуцента ингибитора не было полностью высушено перед инкубацией в течение ночи, штамм-ингибитор распространится, и четко очерченное пятно не сформируется. Кроме того, если штамм-конкурент распылен неравномерно, это может привести к неоднородному распределению бактерий. Наконец, если концентрация штамма-конкурента слишком высока, он может начать расти поверх штамма-ингибитора, что в крайних случаях может привести к смене ролей штамма-конкурента и штамма-ингибитора.

После освоения данной методики на каждую тестируемую пару изолятов будет затрачиваться один час, распределенный на четыре дня. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости равномерного распыления и обеспечении надлежащего количества повторностей между анализами. После выполнения данной процедуры данные об ингибировании можно наложить на таксономические данные о присутствии или отсутствии определенного вида бактерий в сообществе.

Затем становится возможным определить, влияют ли ингибирующие эффекты на способность вида колонизировать среду. После разработки этот метод позволяет исследователям в области микробиомов сообществ изучать влияние вариативности признаков, таких как прогнозирование антимикробных пептидов, на структуру сообщества при конкурентном вытеснении. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как качественным и количественным образом сравнивать способность одного бактериального изолята конкурентно подавлять рост другого.

Не забывайте, что работа с аэрозольными бактериями может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как работа в шкафу биологической безопасности второго уровня и использование соответствующих СИЗ.