Анализы для обнаружения УФ-отражающих структур и определить их значение в Mate Предпочтение используя SailFin Молли
14 сентября 2016 г.
Этот протокол описывает использование спектрофотометрии для обнаружения ультрафиолетового отражающей структуры на организмы (в данном примере SailFin Molly Poecilia latipinna) и описывает дихотомические тесты выбора для рыб , которые позволяют умозаключения быть сделан на роли ультрафиолетовых репликами во время выбора партнера.
Общая цель регистрации отражения УФ-излучения у таких рыб, как Poecilia latipinna, заключается в том, чтобы понять, как структуры, отражающие УФ-свет, могут влиять на брачное поведение данного вида. Этот метод позволяет определить такие предпочтения при выборе партнера, как значимость УФ-сигналов и то, используются ли они обоими полами. Основным преимуществом данного метода является возможность обнаружения сигналов, которые могут быть невидимы для человека, но могут иметь большое значение для рыб.
Для данного протокола сначала откалибруйте спектрофотометр и источник света по известному белому стандарту. Перед проведением всех калибровок освещение в помещении должно быть приглушенным. Откалибруйте прибор по всем длинам волн, которые будут измеряться, включая УФ-длины волн в диапазоне от 300 до 400 нанометров.
Теперь наденьте перчатки и подвергните рыбу анестезии в 5% растворе метансульфоната этил-3-аминобензоата, известного как MS222, буферизованном равным количеством гидрокарбоната натрия. Когда рыба перестанет реагировать, немедленно перенесите ее на черный небликующий фон. Перед проведением измерений снова приглушите свет в помещении.
Для записи данных коэффициента отражения используйте программное обеспечение для анализа. Чтобы повторить данные настройки, установите время интегрирования на 2000 секунд. Установите среднее количество сканирований на два, а значение сглаживания пикселей — на пять.
Теперь измерьте коэффициент отражения рыбы с помощью волоконно-оптического зонда. Держите зонд так, чтобы между волоконной оптикой и телом был угол 45 градусов. Вычислите среднее значение по нескольким сканированиям для каждого участка тела.
Проверьте коэффициент отражения для нескольких участков тела и определите наличие различий между отдельными особями. По завершении процедуры при желании нанесите коммерческий защитный препарат для восстановления слизистого слоя, после чего верните рыбу в резервуар для содержания с хорошим насыщением кислородом. После восстановления у рыбы нормализуются плавание и ритм движения жаберных крышек.
В данном тесте используется резервуар с камерами выбора, оснащенный УФ- и непрозрачными фильтрами. Когда перегородки из плексигласа удаляются, рыба в нейтральной камере может видеть свет полного спектра или свет без УФ-излучения благодаря фильтрам, установленным в разных частях резервуара. Для P.latipinna используйте тестовый аквариум объемом 75,7 литра.
Перед каждым тестом убедитесь, что между тремя секциями аквариума отсутствуют общие водные потоки или ольфакторные сигналы. Для проведения теста используйте половозрелых особей. Для самок P.latipinna выбирайте рыб в течение 48 часов после метания икры, а самцов — тех, кто находился в изоляции не менее 24 часов.
Для проведения теста сначала перенесите подопытное животное в нейтральный отсек. Затем выберите двух потенциальных партнеров для спаривания, которые максимально схожи друг с другом по размеру, окраске и характеристикам брачного поведения. Сопоставление по цвету можно выполнить точно с помощью приборов или приблизительно на глаз.
Теперь при полноспектральном освещении поместите одного из двух потенциальных партнеров в каждый из двух отсеков выбора. Непрозрачные и УФ-фильтры, а также перегородки отсеков должны быть установлены. Дайте животным адаптироваться к этим условиям в течение 15 минут.
Для каждого опыта случайным образом определите, в каком отделении будет установлен УФ-фильтр. Затем снимите непрозрачные крышки с перегородок. Через 15 минут с помощью секундомера начните фиксировать время, которое фокальная особь проводит в определенных зонах предпочтения.
Область в пределах двух длин тела от выбранного отсека считается зоной предпочтения. В качестве альтернативы можно использовать программное обеспечение для регистрации событий. Регистрируйте активность рыбы в течение 15 минут.
Если рыба не посетила каждую зону предпочтения хотя бы один раз, считайте ее невосприимчивой и исключите из данных эксперимента. Измерение отражения УФ-излучения у P.latipinna показывает, что оба пола обладают УФ-характеристиками, которые варьируются между особями. Эти признаки наиболее выражены вдоль боков их тел.
После обнаружения УФ-признаков тест на дискриминацию показал, что самки, в отличие от самцов, используют эти характеристики при выборе партнера для спаривания. Поскольку УФ-признаки присутствуют у обоих полов, возможно, они задействованы в других социальных взаимодействиях, таких как кооперированное плавание (шоалинг) или поиск пищи. После освоения методы измерения УФ-излучения могут быть выполнены менее чем за два часа.
Испытания по выбору партнера могут быть завершены менее чем за час для каждой рыбы. При выполнении данной процедуры важно убедиться, что рыбы находятся в репродуктивно восприимчивом состоянии. После завершения этой процедуры можно провести дополнительные эксперименты для изучения роли УФ-признаков в индивидуальном или видовом распознавании.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается использование спектрофотометрии для обнаружения ультрафиолетовых отражающих структур у организмов, в частности у широкоплавниковой молли Poecilia latipinna. Приводятся тесты с дихотомическим выбором для рыб, которые позволяют сделать выводы о роли ультрафиолетовых сигналов при выборе партнера.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая экология
- Коммуникация животных
Обзор
- Изучение отражения УФ-излучения у рыб может дать представление о брачном поведении.
- УФ-сигналы могут играть значительную роль в выборе партнера.
- Детекция отражения УФ-излучения требует применения специализированных методов.
- Рыбы могут воспринимать сигналы, которые невидимы для человека.
Цель исследования
- Изучить влияние структур, отражающих УФ-излучение, на брачное поведение.
- Определить, играют ли УФ-сигналы важную роль в выборе партнера у Poecilia latipinna.
- Оценить использование УФ-сигналов обоими полами в процессе спаривания.
Используемые методы
- Калибровка спектрофотометра и источника света по известному белому стандарту.
- Измерение длин волн в УФ-диапазоне от 300 до 400 нанометров.
- Проведение тестов с дихотомическим выбором для рыб.
- Наблюдение за предпочтениями при спаривании на основе УФ-сигналов.
Основные результаты
- Идентификация структур, отражающих УФ-излучение, у Poecilia latipinna.
- Доказательство того, что УФ-сигналы влияют на выбор партнера.
- Результаты свидетельствуют о том, что УФ-сигналы могут использоваться особями обоих полов.
- Демонстрация эффективности спектрофотометрии в биологических исследованиях.
Заключение
- Отражение в УФ-диапазоне играет решающую роль в брачном поведении Poecilia latipinna.
- Понимание этих сигналов может расширить знания о коммуникации рыб.
- Описанные методы могут быть применены к другим видам для проведения аналогичных исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание невизуальных сенсорных сигналов, таких как отражение УФ-излучения, расширяет возможности валидации мишеней в поведенческой нейробиологии, выявляя механистически значимые пути в процессе принятия социальных решений. Данный анализ позволяет проводить фенотипический скрининг зависимого от сигналов поведения, что способствует снижению механистических рисков в доклинических моделях, где сенсорное восприятие влияет на терапевтический ответ. Метод обеспечивает получение количественных, воспроизводимых результатов, что повышает прогностическую достоверность исследований взаимодействия с мишенями в нейронных цепях, регулирующих выбор партнера и социальную аффилиацию.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы о поведении, обусловленном сенсорным восприятием, путем выделения отражения УФ-лучей в качестве измеряемой биологической переменной.
- Практическая ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет стандартизированного выявления УФ-отражающих структур у особей разного пола и возраста.
- Прогностическая ценность: способствует отбору приоритетных направлений исследований путем определения того, оказывают ли УФ-сигналы значительное влияние на выбор партнера самками моллий-парусников.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов работы путем подтверждения наличия и вариабельности УФ-признаков в различных областях тела.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа за счет калибровки спектрофотометра по УФ-длинам волн (300–400 nm) и соблюдения постоянного угла наклона оптоволоконного зонда в 45 градусов.
- Масштабируемость: Подчеркивается готовность к скринингу и возможность повторного использования платформы, при этом измерение УФ-характеристик занимает менее двух часов на одну рыбу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обсуждается значимость для понимания заболеваний путем установления связи между выбором партнера, опосредованным УФ-излучением, и более широкими социальными взаимодействиями, такими как образование косяков или поиск пищи, что указывает на возможную роль в распознавании собственного вида.
- Продвижение с учетом рисков: Описывается преемственность от стадии открытия до доклинической валидации, демонстрируя, что УФ-признаки присутствуют у обоих полов, но имеют поведенческое значение только у самок, что позволяет моделировать специфический для каждого пола ответ.
- Механистическая минимизация рисков: Основное внимание уделяется прогностической ценности снижения рисков путем демонстрации того, как манипуляция сенсорными сигналами (фильтры, блокирующие УФ-излучение) изменяет поведенческий результат в тестах с дихотомическим выбором.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Определяет место метода в континууме открытий — от ранних этапов поиска до идентификации соединений-лидеров, обеспечивая проверку гипотез о сенсорных путях и поведенческое фенотипирование перед проведением скрининга соединений.
- Открытия в биологии: объясняется, как данный метод поддерживает проверку гипотез путем количественного определения вариаций отражения УФ-излучения и их связи с зонами предпочтения при спаривании, определенными как область в пределах двух длин тела от камеры выбора.
- Скрининг: описывается готовность анализа к применению посредством дизайна теста с дихотомическим выбором с использованием УФ- и непрозрачных фильтров в аквариуме объемом 75.7 литра, что позволяет надежно оценивать соединения, модулирующие сенсорное восприятие.
- Аналитика: освещаются такие измерения, как время пребывания в зонах предпочтения, зафиксированное с помощью секундомера или программного обеспечения для регистрации событий, что обеспечивает количественные данные для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: метод связывается с преклинической преемственностью, демонстрируя, что УФ-признаки могут лежать в основе индивидуального или видового распознавания, что указывает на потенциал согласования биомаркеров в моделях социального поведения.
- Корпоративное повторное использование: метод представлен как многократно используемая возможность, а не как одноразовая техника, применимая для различных видов рыб при обнаружении УФ-сигналов и стандартизации поведенческого анализа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности в поведении, обусловленном сенсорными стимулами.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость измерений отражения в УФ-диапазоне и тестирования предпочтений при выборе партнера.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах за счет раннего выявления использования половых специфических стимулов.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков и решения о дальнейшем продвижении на основе того, оказывают ли УФ-стимулы значительное влияние на выбор партнера в целевых популяциях.
Рекомендации по внедрению
- Необходимый уровень научной подготовки в области спектрофотометрии, работы с рыбами и протоколов поведенческого наблюдения.
- Требования к приборному и аналитическому обеспечению, включая спектрофотометр, откалиброванный на диапазон 300–400 nm, волоконно-оптический зонд, анестетик MS222 и резервуар с камерами выбора, оснащенный УФ-фильтрами или непрозрачными фильтрами.
- Требования к межгрупповой стандартизации протоколов анестезии (5% MS222, буферизированный бикарбонатом натрия), условий освещения и определений зоны предпочтения.
- Особенности адаптации для различных модельных систем, включая видоспецифичную локализацию УФ-признаков и отбор полововозбужденных особей (самки в течение 48 часов после родов, самцы после 24 часов изоляции).
- Практические ограничения, подтвержденные исходными материалами: рыбы должны быть репродуктивно активны; отсутствие хотя бы одного посещения каждой зоны предпочтения ведет к исключению данных из анализа.
