Мультимодальные Количественный фаза обработки изображений с цифровой голографической микроскопии Оценивает Кишечные Точно Воспаление и эпителиальной заживлении ран
13 сентября 2016 г.
Точная оценка противовоспалительных эффектов имеет первостепенное значение для оценки потенциальных новых препаратов для лечения воспалительных заболеваний кишечника. Цифровая голографическая микроскопия обеспечивает оценку воспаления в образцах тканей толстой кишки мыши и человека, а также автоматизированную мультимодальную оценку заживления эпителиальных ран in vitro.
Общая цель данного исследования заключается в использовании цифровой голографической микроскопии или ДГМ для получения автоматизированной количественной фазовой контрастной визуализации образцов ткани толстой кишки при воспалении кишечника без пятен для мультимодальной оценки заживления эпителиальных ран in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспаления желудочно-кишечного тракта и заживления ран о деятельности воспаленных заболеваний человека и моря. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет обнаруживать и количественно оценивать клетки и ткани по физическим параметрам безмазочным и объективным образом. Демонстрировать процедуры будет Фиттест Кетелхут, техник из Центра биомедицинских технологий.
Установите клеточную культуру, инкубируйте четыре раза по десять до пятой, Caco по две клетки на сантиметр квадрат в 35-миллиметровых чашках Петри, оснащенных высококультуральными вставками в среде RPMI, дополненной FBS и антибиотиками при 37 градусах Цельсия при влажности 95% и пяти процентах углекислого газа. Через двое суток обработайте клетки интересующим средством и верните культуры в инкубатор еще на 24 часа. На следующий день аспирируйте надосадочную жидкость и с помощью пинцета удалите вставки.
Промойте культуру один-два раза одним миллилитром буферной среды для культивирования клеток HEPES, чтобы удалить все мертвые клетки и любые оставшиеся клеточные компоненты из области раны. Затем добавьте два миллилитра свежей буферной среды HEPES и закройте тарелку. Теперь поместите чашку Петри в цифровой голографический микроскоп и выберите объектив с 10-кратным увеличением.
Откройте программное обеспечение для получения изображений и выберите режим визуализации светлого поля. Установите камеру нагрева на 37 градусов Цельсия и поместите культуру в камеру нагрева. Затем перемещайте поле просмотра до тех пор, пока в окне мониторинга в реальном времени не будет визуализирована подходящая рана с одним огромным клеточным слоем и прямыми границами с обеих сторон без мертвых клеток или сыворотки.
Сделайте снимок начальной области раны в белом свете. Затем включите подсветку белым светом и выберите режим цифровой голографической микроскопии. Включите лазерную подсветку и выберите время экспозиции менее трех миллисекунд для записи голограммы.
Если голографические интерференционные полосы вне доступа выглядят с адекватным контрастом, захватите образец голограммы и реконструируйте количественное фазовое изображение с помощью программного обеспечения для реконструкции для проверки качества изображения. Затем начните покадровое ДГМ-наблюдение за раной, остановив запись в соответствующей конечной точке, и получите окончательное изображение образца при освещении белым светом. Для острой индукции сульфата натрия декстрана или колита DSS дайте мышам аблибидим три грамма DSS, растворенных в 100 миллилитрах автоклавной воды.
Через семь дней получите срезы срезов швейцарской толстой кишки толщиной семь микрометров у контрольных и обработанных животных. Погрузите каждую секцию в 50-100 микролитров PBS и накройте образцы индивидуальными стеклянными покровными стеклами. Убедитесь, что на дне предметных стекол нет пыли и других загрязнений.
Затем поместите первое предметное стекло на предметный столик микроскопа и отрегулируйте поле зрения до тех пор, пока не станет видна интересующая область ткани. Сфокусируйте образец и сделайте яркое изображение в программном обеспечении для получения изображений. Затем выберите режим визуализации DHM и переключитесь на лазерную подсветку.
Установите время экспозиции менее трех миллисекунд и убедитесь, что голографические интерференционные полосы вне доступа отображаются с достаточной контрастностью в окне изображения в реальном времени. Затем сделайте цифровую голограмму ткани. Эндоскопически признаки умеренного и тяжелого колита включают утолщение стенки толстой кишки, изменения сосудистого рисунка, уплотнения волокон и зернистость поверхности слизистой оболочки.
Традиционная гистологическая оценка срезов толстой кишки выявляет выраженный отек в стенке толстой кишки DSS, получавших лечение, по сравнению с контрольными животными, преимущественно расположенными в подслизистой оболочке. Соответствующие количественные изображения фазового контраста ДГМ и соответствующие карты показателя преломления также демонстрируют, что эти тканевые изменения без видимых различий в плотности эпителиальной менстромы особенно заметны в образцах нативных неокрашенных тканей. Показатель преломления значительно снижен в эпителии, подслизистой оболочке и строме мышей с колитиками по сравнению со здоровой контрольной группой со значительной корреляцией между относительной потерей массы тела и показателем преломления у экспериментальных животных.
Здесь показан репрезентативный непрерывный мониторинг анализа заживления ран с помощью цифровой голографической микроскопии в течение 45 часов. Это позволяет рассчитать площадь покрытой клетки поверхности, среднюю толщину клетки и клеточную сухую массу в процессе заживления. Мы показали, что ДГМ позволяет непрерывно контролировать заживление эпителиальных ран, одновременно предоставляя биоосновную информацию об изменениях клеток, вызванных цитокинами.
Кроме того, мы демонстрируем точную оценку гистологических повреждений на моделях колита и образцах тканей толстой кишки человека с помощью ДГМ путем измерения изменений показателя преломления. Поскольку ДГМ основан на обнаружении задержки длины оптического пути, абсолютные биофизические параметры, такие как плотность ткани, сухая масса или толщина клеток, могут быть проанализированы с помощью количественной фазовой контрастной томографии без пятен. Кульминация ДГМ с помощью распространенных исследовательских микроскопов и надежность метода прокладывают путь к рутинному применению этого метода в клеточной биологии и цифровой патологии.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать цифровую голографическую микроскопию для анализа тканей живых клеточных культур в условиях биомедицинской лаборатории. В заключение следует отметить, что ДГМ создает ценный, новый и количественный инструмент для оценки абсолютных параметров воспаления, а также для упрощенной количественной оценки добровольного эпителия in vitro с высоким потенциалом для использования в трансляционной диагностике.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании используется цифровая голографическая микроскопия (DHM) для автоматизированной количественной визуализации воспаления кишечника в образцах тканей толстой кишки без применения красителей. Метод направлен на улучшение оценки заживления эпителиальных ран in vitro, что позволяет глубже понять механизмы воспалительных процессов в желудочно-кишечном тракте.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Гастроэнтерология
Теоретическая часть
- Воспалительные заболевания кишечника требуют точной оценки противовоспалительного эффекта.
- DHM позволяет проводить объективную визуализацию без необходимости окрашивания.
- Данный метод позволяет эффективно количественно определять параметры клеток и тканей.
- Понимание механизмов воспаления и заживления ран имеет решающее значение в исследованиях желудочно-кишечного тракта.
Цель исследования
- Для оценки воспаления кишечника в образцах тканей толстой кишки.
- Для оценки заживления эпителиальных ран in vitro с помощью DHM.
- Для обеспечения мультимодального подхода к изучению воспаления желудочно-кишечного тракта.
Используемые методы
- Цифровая голографическая микроскопия для визуализации.
- Культивирование клеток Caco-2 в контролируемой среде.
- Обработка клеток интересующими агентами после инкубации.
- Автоматизированный анализ воспаления и заживления ран.
Основные результаты
- ДГМ позволяет эффективно количественно оценить воспаление в тканях мышей и человека.
- Автоматизированная визуализация обеспечивает получение объективных данных о заживлении эпителиальных ран.
- Метод демонстрирует потенциал для оценки лекарственных препаратов при воспалительных заболеваниях кишечника.
- Результаты подтверждают целесообразность применения ДГМ в исследованиях желудочно-кишечного тракта.
Выводы
- Цифровая голографическая микроскопия является ценным инструментом для оценки воспаления кишечника.
- Данный метод углубляет понимание процессов заживления эпителиальных ран.
- ЦГМ может способствовать разработке новых методов лечения воспалительных заболеваний кишечника.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Цифровая голографическая микроскопия (ЦГМ) обеспечивает количественную фазово-контрастную визуализацию без применения красителей, что позволяет объективно оценивать воспаление кишечника и заживление эпителиальных ран без нарушения целостности образца. Эта возможность поддерживает валидацию мишеней на ранних стадиях и снижение механистических рисков при поиске лекарственных средств для лечения воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), предоставляя абсолютные биофизические параметры, такие как плотность ткани, сухая масса и толщина слоя. Данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей за счет снижения вариабельности, связанной с окрашиванием и субъективной гистологической интерпретацией, тем самым улучшая трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинической разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения изменений показателя преломления как прямого коррелята изменений плотности воспаленной ткани толстой кишки.
- Практическая ценность: обеспечивает объективную безмаркерную количественную оценку воспалительных изменений в различных слоях ткани, снижая зависимость от экспертной гистологической оценки.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет значимой корреляции между сдвигами показателя преломления и маркерами активности заболевания, такими как потеря массы тела в моделях колита.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Облегчает подготовку валидированных биологических систем для последующих этапов анализа за счет обеспечения непрерывного автоматизированного мониторинга заживления эпителиальных ран in vitro.
- Практическая ценность: Позволяет одновременно определять площадь раны, сухую массу клеток и толщину слоя, обеспечивая многопараметрический анализ для скрининга соединений.
- Готовность метода: Обеспечивает масштабируемую и воспроизводимую количественную оценку динамики заживления во времени, что позволяет повторно использовать платформу для оценки противовоспалительных соединений и средств регенерации тканей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: демонстрирует применимость как к образцам тканей кишечника мышей, так и человека, что повышает значимость метода для изучения патофизиологии человека.
- Снижение механистических рисков: позволяет количественно оценить изменения в строме и эпителии в моделях колита без окрашивания, обеспечивая понимание механизмов действия препаратов на уровне тканей.
- Доклиническая согласованность: поддерживает принятие обоснованных решений о продвижении разработки с учетом рисков, предоставляя количественные и воспроизводимые конечные точки для оценки гистологических повреждений и процессов заживления ран.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Метод DHM интегрируется в непрерывный процесс поиска лекарственных средств — от ранней валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, особенно в отношении путей воспаления желудочно-кишечного тракта и регенерации слизистой оболочки.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение механизмов путем количественной оценки безмаркерных биофизических изменений плотности ткани и морфологии клеток в процессе воспаления и заживления.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет автоматизированной таймлапс-визуализации закрытия раны и одновременного измерения сухой массы и толщины, что позволяет проводить надежную оценку соединений.
- Аналитика: генерирует количественные данные, включая карты показателя преломления, плотность ткани, сухую массу и толщину слоя, что облегчает объективное сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает результаты фундаментальных открытий с доклинической валидацией благодаря подтвержденной применимости как на моделях колита у мышей, так и на образцах тканей человека.
- Корпоративное повторное использование: позиционирует DHM как многократно используемую, платформо-совместимую технологию для безмаркерной количественной визуализации различных моделей заболеваний и типов клеток.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую достоверность за счет абсолютного количественного определения биофизических параметров без окрашивания, что снижает механистическую неопределенность в анализах воспаления и заживления ран.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет автоматизированного сбора и анализа изображений, сводя к минимуму вариабельность, зависящую от оператора.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет предоставления объективных многопараметрических данных, которые снижают биологические риски на поздних стадиях разработки терапевтических средств для лечения ВЗК.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе количественных гистологических и функциональных конечных точек заживления ран.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в области количественной фазовой визуализации и цифровой голографической реконструкции для точной интерпретации данных.
- Зависимость от инструментария, способного осуществлять захват голограмм с помощью лазера, и программного обеспечения для реконструкции фазы с системой контроля условий окружающей среды (например, термостатом).
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов визуализации и конвейеров анализа для обеспечения согласованности данных между группами фундаментальных исследований и доклинических испытаний.
- Требуется адаптация метода при его применении к различным модельным системам (например, 2D-монослоям по сравнению с 3D-срезами тканей) при сохранении точности количественных показателей.
- Ограничения по полю зрения и разрешению при оценке больших участков ткани, хотя метод подходит для направленного гистологического и клеточного анализа, что продемонстрировано в тестах на тканях толстой кишки и заживление ран.
