Свет-опосредованной Формирование и структурирование гидрогелей для клеточных культур

Общая цель этой процедуры заключается в формировании, моделировании и инкапсуляции клеток в экстраклеточные матрицы на основе синтетических полимеров. Этот метод может быть использован для решения критических биологических вопросов, связанных с идентификацией внеклеточных сигналов, которые регулируют реакции клеток в гетерогенных микросредах. Основное преимущество этого метода заключается в том, что для инкапсуляции и культивирования клеток создается прочная синтетическая матрица с использованием протоколов и доступных материалов.

Этот метод может быть использован для контролируемого культивирования клеток и для изучения клеточного ответа in vitro. Он может быть применен к другим системам, включая доставку лекарств и тканевую инженерию. Подготовьте материалы для формирования гидрогеля так, как описано в текстовом протоколе.

Прикрепите коллиматорную линзу к концу наполненного жидкостью световода, чтобы обеспечить относительно равномерную интенсивность света на всех образцах. Отрегулируйте расстояние световода от образцов, чтобы получить размер пятна, который будет охватывать интересующие образцы. Чтобы сделать гидрогели без рисунка, приготовьте густые гидрогели, отлитые в виде наконечников шприцев, пипетируя от 10 до 20 микролитров раствора прекурсора геля в кончик стерильно отрезанного шприца.

Сделайте один гель на шприц так, чтобы его толщина составляла примерно от 0,5 до 1,5 миллиметра, в зависимости от объема и диаметра шприца. Приготовьте тонкие гидрогели в формах для предметных стекол, поместив резиновую прокладку по краям предметного стекла без покрытия. Затем нанесите пипеткой от 5 до 10 микролитров раствора гелевого предшественника на предметное стекло без покрытия.

И поместите стеклянное стекло, покрытое антиадгезивным покрытием, поверх раствора геля. Закрепите предметные стекла небольшими связующими зажимами для стабилизации. Установите интенсивность лампы так, чтобы она достигала 10 милливатт на квадратный сантиметр на поверхности геля для форм с наконечниками шприцев или форм для стеклянных стекол.

Использование радиометра для определения интенсивности. И поставьте формочки под лампу. Нанесите свет на одну-пять минут, чтобы обеспечить полную полимеризацию гелей.

Используйте более короткое время полимеризации для гелей с повышенным содержанием полиэтиленгликоля терефталата. И более длительное время для гелей с меньшим содержанием для получения полностью полимеризованных гидрогелей с модулями в пределах мягких тканей. Поместите гели из форм с наконечником шприца в стерильную необработанную 48-луночную пластину и поместите стеклянные предметные стекла в стерильную посуду.

Чтобы приготовить гидрогели с рисунком, приготовьте раствор прекурсора, как описано в текстовом протоколе, и энергично пипетируйте раствор, чтобы обеспечить равномерное смешивание раствора. Затем покройте предварительно сформированные гели пентоновым пептидом в растворе фотоинициатора фосфата лития и инкубируйте в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации удалите излишки раствора.

Если гели отливаются в кончике шприца, с помощью шпателя аккуратно переложите его с 48-луночной пластины на стерильное стеклостекло для нанесения рисунка. Поместите фотомаску с нужным рисунком прямо поверх шприца и стекла формованными гелями. Убедитесь, что напечатанная часть маски соприкасается с гелем для оптимальной точности рисунка.

Поместите образцы под лампу и излучайте в течение одной минуты. После нанесения рисунка поместите формованные гели шприцем в стерильную 48 хорошо обработанную пластину без культуры тканей. Поместите на стеклянные предметные стекла формованные гели, которые прилипли к стеклянным предметным стеклам, в стерильную посуду.

Промойте три раза по 15 минут культивируемой средой или подходящим буфером в зависимости от запланированных экспериментов. Чтобы подготовиться к обнаружению и количественному определению свободных тиолов в гидрогелях с фоторисунком, сначала приготовьте растворы и выполните расчеты, как описано в текстовом протоколе. Сформируйте тонкие гидрогели для нанесения рисунка, как и раньше.

В частности, сделайте гели с избытком свободных тиолов и смоделируйте половину этих образцов пентоновым пептидом, используя прозрачную покровную планку, чтобы полностью обнажить весь гель светом. Поместите гели с рисунком и без рисунка в лунки 48-луночного планшета. Промойте в течение 15 минут, три раза реакционным буфером Эллмана, чтобы обеспечить диффузию прореагировавших веществ из геля и возникновение равновесного набухания.

Добавьте в гели для полоскания дополнительный реакционный буфер Эллмана, чтобы объем набухшего геля с реакционным буфером был кратен 20 микролитрам. Например, если прогнозируемый объем набухшего геля составляет 15 микролитров, добавьте пять микролитров реакционного буфера. А если прогнозируемый объем набухшего геля составляет 30 микролитров, добавьте 10 микролитров реакционного буфера.

Пипетку сикстинских стандартов в отдельные лунки 48-луночного планшета кратно 20 микролитрам. В зависимости от объема, использованного на предыдущем шаге. Например, если на предыдущем этапе был увеличен объем геля, плюс дополнительный реакционный буфер, равный 40 микролитрам, добавьте по 40 микролитров каждого стандарта в отдельные пустые лунки.

Затем разбавьте реагент Эллмана и реакционный буфер. Добавляйте разведенный реагент Эллмана в лунки, содержащие стандарты и образцы. Для проб на 20 микролитров добавьте в каждую лунку по 183,6 микролитра раствора.

Инкубировать или поместить в шейкер на один час тридцать минут или до тех пор, пока цвет раствора не совпадет с цветом гелей при визуальном осмотре, чтобы обеспечить достаточную диффузию желтого 2-нитро-5-тиобензойного дианиона, который образуется при реакции реагента Эллмана со свободными тиолами из геля. Возьмите 100 микролитров раствора из образцов и эталонов и поместите в лунки на 96 лунок планшета. Считайте абсорбцию на 405 нанометрах на планшетном считывателе.

Чтобы визуализировать фотоузоры, удалите излишки реакционного буфера, аккуратно протерев края гидрогеля салфеткой. Пипеткой реактив Эллмана наносится непосредственно на поверхность геля. Мгновенное изображение на световом микроскопе с 10-кратным увеличением или на стереомикроскопе с цветной камерой.

Соберите клетки и подготовьте их к инкапсуляции, как описано в текстовом протоколе. Сразу после аспирации PBS суспендируйте гранулированные клетки в растворе предшественника до конечной концентрации пять тысяч клеток на микролитр. Оставьте соответствующую концентрацию свободных тиолов для последующей реакции с пентоновым пептидом.

Если требуется фотовыкройка. Сформируйте, полимеризуйте и смоделируйте гидрогели, как и раньше. Промойте гели в течение 10 минут, три раза, в питательной среде после нанесения рисунка, чтобы удалить непрореагировавшие вещества и избыток фотоинициатора фосфата лития.

Инкубируйте гели в питательной среде при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2 до желаемого момента времени для дальнейшего анализа. Пополняйте носитель каждые 48 часов, или как определено в приложениях. Чтобы определить жизнеспособность инкапсулированных клеток, сначала удалите питательную среду из гелей и промойте в течение 15 минут три раза PBS, чтобы обеспечить диффузию среды из гелей.

Добавьте два микролитра размороженного двухмиллимолярного гомодимер-1 этидия и 0,5 микролитра размороженных четырех миллимолярных растворов кальциевой аммиачной амминецитаны к одному миллилитру стерильного PBS. Vortex для обеспечения полного перемешивания. Добавьте 300 микролитров стоячего раствора в каждый шприц с формовочным гелем в 48 лунок или столько, чтобы покрыть поверхность геля на предметном стекле в стерильной посуде.

И высиживать в течение 45 минут. Удалите излишки стоячего раствора и смойте, чтобы удалить излишки красителя с гелей. Визуализируйте клетки на конфокальном микроскопе.

Или на эпифлуоресцентном микроскопе с возможностью 10-кратного увеличения. И возбуждение 488 нм, и излучение 525 нм. Концентрация свободного тиола в неструктурированных и структурированных гидрогелях, количественно определенная с помощью Эллмана, показала, что гидрогели, первоначально полимеризованные в течение одной минуты и в течение пяти минут, имеют статистически схожие концентрации свободного тиола, что указывает на быструю реакцию и полное гелеобразование в течение одной минуты.

Последующее объемное структурирование гелей, инкубированных с пентонными пептидами в течение 30 минут и в течение одного часа и 30 минут, приводит к снижению концентрации свободного тиола на 60-80 процентов, что указывает на эффективную модификацию избытка тиола. Фотоузоры, образованные излучением света через образцы, покрытые масками, напечатанными здесь линиями, можно наблюдать в двух измерениях с применением реагента Эллмана. Или в трех измерениях с включением флуоресцентных пептидов в последующую визуализацию.

Взрослые стволовые клетки человека, инкапсулированные в хирогели, были обработаны красителями на жизнеспособность и гидротоксичность. И визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. Жизнеспособные клетки без повреждения мембраны помечены зеленым цветом и указывают на выживание клеток через сутки после инкапсуляции.

Клетки начинают распространяться внутри матрицы через шесть дней после инкапсуляции. Как показано на врезке. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о соблюдении стерильных и осторожных процедур обращения, чтобы предотвратить повреждение клеток после инкапсуляции из-за введения загрязняющих веществ или механического отверстивания.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуноокрашивание, проточная цитометрия и экспрессия генов, для изучения функции и судьбы клеток в ответ на внеклеточную среду. Этот метод прокладывает путь исследователям в области биологии, биоинженерии и медицины к изучению эрозии тканевых областей или прогрессирования заболевания в синтетических внеклеточных матрицах с определяемым пользователем контролем свойств, к разработке новых стратегий лечения. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как инкапсулировать клетки и создавать мягкие матрицы для контролируемых исследований клеточных культур.