Одиночных молекул Super-Resolution Imaging фосфатидилинозит 4,5-бисфосфат в плазматической мембране с новыми флуоресцентных зондов
15 октября 2016 г.
PI (4,5) P 2 регулирует различные клеточные функции, но его наноразмерных организация в клеточной мембране плазмы мало изучен. Навешивая PI (4,5) P 2 с двухцветными флуоресцентным зондом , слитого с доменом Pleckstrin гомологий, мы опишем новый подход для изучения PI (4,5) P 2 пространственное распределение в мембране плазмы в нанометровом масштабе ,
Общая цель данной работы заключается в том, чтобы излучать наноразмерное распределение фосфатидилинозитола 4,5-бисфосфата в плазматической мембране клетки с помощью флуоресцентной микроскопии локализации одной молекулы. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы о фосфоинозитидной сигнализации. Например, какова наноразмерная организация фосфоинозитидов под сигнальным комплексом в клеточной мембране?
Основными преимуществами этого метода являются высокое пространственное разрешение и обход обработки моющим средством, что является основной проблемой при морфологических исследованиях фосфолипидов. Этот подход включает в себя три основных этапа. Шаг первый:Подготовка листа плазматической мембраны из живых клеток.
Шаг второй: Мечение фосфоинозитидов и визуализация флуоресценции одной молекулы. Шаг третий: Локализация одной молекулы и визуализационная реконструкция. В день эксперимента чехол для шерсти содержит от половины до одного миллилитра PDL.
Через один-два часа впитайте излишки PDL папиросной бумагой с края покровного листа. Затем храните покровные стекла на металлической пластине при температуре четыре градуса Цельсия. Затем предварительно промыть клетки INS-1, выращенные на покровных листах, от половины до одного миллилитра ледяного PBS, содержащего один миллимоляр EGTA.
Повторите эту стирку три раза и впитайте излишки PBS. Теперь с помощью пинцета поместите покровные листы с культивируемыми клетками на покрытые PDL покровные листы клеткой вниз. Делайте это на охлажденной металлической пластине.
Затем перенесите пластину на четыре градуса Цельсия на семь-десять минут, чтобы дать ячейкам время прикрепиться. Затем с помощью пинцета аккуратно снимите нагруженный ячейкой покровный лист, который оставит тонкий слой клеточной мембраны на покровном листе с покрытием PDL. Затем аккуратно промойте мембранные листы от половины до одного миллилитра ледяного PBS.
Теперь закрепите каждый лист мембраны примерно в 150 микролитрах ледяного четырехпроцентного PFA с 0,2 процентом глутаральдегида в PBS. Дайте мембранам зафиксироваться в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После фиксации либо сразу приступайте к визуализации, либо накройте препараты ледяным PBS и храните при температуре четыре градуса Цельсия.
Если используются датчики pH, настоятельно рекомендуется немедленная визуализация. Для этой процедуры используется система SMLM на основе микроскопа TIRF. Перед визуализацией мембран разведите один микролитр раствора флуоресцентных шариков в 10 миллилитрах PBS с 50 миллимолярами хлорида магния.
Затем загрузите образец в камеру визуализации и добавьте 200 микролитров разбавленного раствора, после чего подождите 10 минут. Далее промойте образец PBS три раза. Теперь запустите систему визуализации PALM.
В соответствующем программном обеспечении для обработки изображений выберите кнопку канала iRFP. Затем найдите клеточную мембрану, экспрессирующую pH-зонды в канале iRFP, используйте флуоресцентные шарики для коррекции дрейфа. Установите нормальный угол TIRF равным 2140, который на 1,5 глубже критического угла TIRF и должен быть углом по умолчанию.
Затем используйте кнопку захвата для сбора обычного изображения TIRF в канале iRFP в качестве эталона. Далее переключитесь на канал PAm-Cherry1, нажав кнопку RFP канала. Затем отрегулируйте полосу прокрутки на площадке AOTF до упора вправо для полного освещения и приложите лазер примерно на 10-20 секунд, чтобы отбелить фоновые флуоресценции мембраны.
Затем установите оптимальную настройку камеры на вкладке формата на два на два. Затем установите протокол быстрого сбора данных на вкладке ND Sequence Acquisition на 30 000 изображений с частотой 20 герц. Затем подайте мощность от 0,1 до 1 процента на 405-нанометровый лазер во время получения изображения, чтобы пространственно изолированные точки в каждом кадре были легко идентифицируемы.
Теперь получите изображения PAm-Cherry1, нажав кнопку «Запустить сейчас». Количество молекул, которые могут быть активированы, будет постепенно уменьшаться в процессе сбора. В ответ постепенно увеличивайте интенсивность 405-нанометрового лазера для поддержания оптимальной плотности сигналов.
Получайте изображения до тех пор, пока не будет активирован весь сигнал PAm-Cherry1. Позже, при обработке и реконструкции изображений, идентифицируйте и локализуйте отдельные молекулярные события из каждого кадра. Установите порог интенсивности фильтрации с номером порога в вейвлете.
Более подробная информация представлена в текстовом протоколе. Пространственное распределение PIP2 чувствительно к различной фиксации при правильной фиксации, описанной в тексте, зонды PIP2 показали равномерное распределение при мечении антителом PIP2 или специфическими доменами pH. Для сравнения, живые клетки, помеченные тегом EGFP, рН-домены не сильно отличаются друг от друга.
Все образцы показали равномерное распределение зондов. Напротив, неоптимальная фиксация приводила к резко-плотным кластерам PIP2 и снижению интенсивности сигнала. В оптимальных условиях фиксации изображения PIP2 в фиксированных клетках со сверхвысоким разрешением выявили однородное распределение зондов в значительной части плазматической мембраны с ограниченными градиентами концентрации.
Некоторые мембранные участки, обогащенные зондами PIP2, были распределены слабо и имели различные размеры. Изображения PALM с живыми ячейками отображают пространственное распределение, аналогичное распределению фиксированных ячеек. Детальный анализ сигналов PIP2 показал, что их динамика на локальных участках была быстрой, но это не привело к существенным изменениям в их общей численности.
Этот метод открывает новый способ для исследователей в области фосфолипидов изучить распределение и активность других подтипов фосфоинозитидов в физиологических условиях.
Обзор
В данном исследовании изучается наноразмерное распределение фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PI(4,5)P2) в плазматической мембране клетки с помощью флуоресцентной микроскопии локализации одиночных молекул. Данный метод позволяет получить сведения о фосфоинозитидном сигналинге и организации фосфоинозитидов в клеточных мембранах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретические основы
- PI(4,5)P2 играет важную роль в различных клеточных функциях.
- Наноразмерная организация PI(4,5)P2 в плазматической мембране изучена недостаточно.
- Существующие методы часто включают обработку детергентами, что может повлиять на морфологию фосфолипидов.
- Данное исследование направлено на преодоление этих ограничений с помощью нового метода визуализации.
Цель исследования
- Выявить наноразмерное распределение PI(4,5)P2 в плазматической мембране.
- Изучить динамику фосфоинозитидного сигналинга.
- Разработать метод, исключающий обработку детергентами, для более качественного изучения морфологии.
Используемые методы
- Приготовление пластов плазматической мембраны из живых клеток.
- Маркирование фосфоинозитидов и визуализация с помощью одномолекулярной флуоресцентной микроскопии.
- Сбор и обработка изображений для локализации отдельных молекулярных событий.
- Сравнение методов фиксации для оценки их влияния на распределение PI(4,5)P2.
Основные результаты
- Оптимальные условия фиксации выявили гомогенное распределение PI(4,5)P2 в плазматической мембране.
- Неоптимальная фиксация приводила к образованию плотных кластеров и снижению интенсивности сигнала.
- Визуализация живых клеток показала паттерны пространственного распределения, аналогичные тем, что наблюдались в фиксированных клетках.
- Динамика PI(4,5)P2 в локальных областях была быстрой, без значительных изменений общего содержания.
Выводы
- В исследовании представлен новый метод изучения распределения фосфоинозитидов.
- Полученные результаты расширяют понимание сигналинга фосфоинозитидов в физиологических условиях.
- Данный метод может быть применен для исследования других подтипов фосфоинозитидов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Понимание наноразмерной организации фосфоинозитидов, таких как PI(4,5)P2, имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в путях передачи сигнала. Данный метод позволяет получить представление о механизмах динамики мембранных липидов без артефактов, вызванных воздействием детергентов, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска. Он решает ключевую задачу валидации мишени, проясняя пространственную организацию, которая имеет значение для взаимодействий препарата с мишенью на плазматической мембране.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы, раскрывая пространственную организацию PI(4,5)P2 — ключевого регулятора ионных каналов и сигнальных комплексов.
- Практическая ценность: Обеспечивает снижение биологических рисков за счет прямой визуализации организации липидных нанодоменов в мембранных средах, приближенных к нативным.
- Прогностическая ценность: Облегчает приоритизацию портфеля препаратов, обеспечивая механистическую ясность в отношении фосфоинозитид-зависимых мишеней в физиологических условиях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем (фиксированных мембранных пластов и живых клеток) для последующих скрининговых анализов, направленных на поиск соединений, модулирующих фосфоинозитиды.
- Практическая ценность: Обеспечение количественных пространственных данных сверхвысокого разрешения, что повышает стандартизацию и воспроизводимость анализа.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных подтипов фосфоинозитидов, что обеспечивает последовательную оценку соединений в процессах поиска новых лекарственных средств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает точность системы при изучении заболеваний за счет сохранения распределения PI(4,5)P2 при визуализации живых клеток, что позволяет экстраполировать результаты на доклинические модели.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет определить, вызваны ли наблюдаемые эффекты передачи сигнала перераспределением липидов, а не изменением их общего количества, что повышает уверенность в выборе мишени.
- Прогностическая достоверность: Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении разработки с учетом рисков, связывая наноразмерную динамику липидов с функциональными исходами в патофизиологических контекстах.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в континуум открытий: от подтверждения гипотезы о мишени и разработки анализа до доклинического подтверждения механизмов действия, что особенно актуально для мишеней, связанных с фосфоинозитидным сигналингом.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей за счет разрешения наноразмерной организации PI(4,5)P2 в микродоменах плазматической мембраны.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу, воспроизводимые количественные пространственные данные, необходимые для надежного скрининга соединений против мишеней, модулирующих липидный обмен.
- Аналитика: обеспечивает результаты локализации и реконструкции отдельных молекул, которые позволяют сравнивать распределение липидов при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность между фундаментальными открытиями и доклиническими исследованиями с помощью визуализации живых клеток, которая отражает паттерны распределения в фиксированных клетках при физиологических условиях.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемый инструментарий визуализации для исследования различных подтипов фосфоинозитидов, сокращая необходимость избыточной разработки методов в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов за счет уменьшения механистической неопределенности в сигнальных путях, опосредованных фосфоинозитидами.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря протоколам с оптимизированной фиксацией и одномолекулярной визуализации с коррекцией дрифта.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) за счет уточнения липид-зависимых механизмов, что снижает биологические риски на поздних этапах продвижения мишени.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с поправкой на риск на основе валидированной пространственной организации ключевых сигнальных липидов мембран.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микроскопией локализации одиночных молекул и методом подготовки плоских листов плазматической мембраны.
- Необходима система SMLM на базе TIRF с лазерной активацией и коррекцией дрифта с использованием флуоресцентных микросфер.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов фиксации во избежание артефактной кластеризации сигналов PI(4,5)P2.
- При расширении исследования на другие подтипы фосфоинозитидов или клеточные модели заболеваний необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Практическое ограничение: при интерпретации сигнала необходимо учитывать быструю локальную динамику, которая не изменяет общую концентрацию липидов, как отмечено в данных по живым клеткам.
