Novel Выделение РНК-связывающих белков Стремительное Методология

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном выделении специфической РНК вместе с белками, которые связаны с ней in vivo. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о метаболизме и регуляции РНК, например, определить совокупность белков, связывающихся с определенным транскриптом. Основным преимуществом данной методики является высокая эффективность выделения, что позволяет в дальнейшем идентифицировать новые белки, ассоциированные с мРНК.

В данном экспресс-методе используется штамм дрожжей, который коэкспрессирует мРНК с меткой MS2 и гибридный белок, состоящий из MS2-связывающего белка и стрептавадин-связывающего белка. Вырастите 500 миллилитров дрожжевых клеток при 30 °C в синтетической декстрозной или селективной среде SD до достижения OD600 от 0,8 до 1,0. Когда клетки будут готовы, центрифугируйте их при 3000 ×g в течение 4 минут при комнатной температуре и удалите супернатант.

Промойте клетки в PBS и повторно центрифугируйте. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в равном объеме среды SD без метионина. Инкубируйте в течение 45–60 минут при 30 °C для индукции экспрессии слитого белка.

Через 45–60 минут отберите 10 миллилитров клеток для экстракции РНК, а оставшиеся клетки используйте для экспресс-очистки. Для начала этой процедуры добавьте к клеткам 1,35 миллилитра 37% формальдегида до конечной концентрации 0,1% для сшивания РНК-белковых комплексов. Продолжайте инкубацию при 30 °C в течение 10 минут.

Для остановки сшивания добавьте 26,5 milliliters 2,5 molar глицина до конечной концентрации 0,125 molar и инкубируйте при 30 degrees Celsius в течение 3 минут. С этого момента держите все образцы на льду и работайте быстро, чтобы минимизировать деградацию RNA. Центрифугируйте клетки при 3000 times G в течение 4 минут при 4 degrees Celsius.

Удалите супернатант, добавьте 45 миллилитров холодного PBS и снова центрифугируйте. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 5 миллилитрах буфера для быстрого лизиса, содержащего высокую концентрацию ингибиторов Rnase. Разделите клеточную суспензию на аликвоты по 500 микролитров в микроцентрифужные пробирки с завинчивающимися крышками и добавьте в каждую аликвоту примерно 400 миллиграммов охлажденных стеклянных бусин.

Лизируйте клетки в бисерном гомогенизаторе в течение трех минут. Немедленно поместите лизат на лед. Перенесите лизат в новые микроцентрифужные пробирки.

Отрежьте верхнюю часть шприца объемом 5 мл и закрепите ее на пустой пробирке объемом 15 мл, чтобы она служила адаптером для пробирок с завинчивающимися крышками. С помощью раскаленной иглы проделайте небольшое отверстие в дне каждой пробирки и поместите их сверху на адаптированные пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте сборки из пробирок при 3000 ×g в течение одной минуты при 4 °C, чтобы элюировать лизат в пробирки объемом 15 мл.

Перенесите фильтрат из каждой пробирки объемом 15 мл в новую пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 10 000 ×g в течение 10 минут при 4 °C для удаления клеточного дебриса. Объедините супернатант из всех пробирок объемом 1,5 мл в одну пробирку объемом 15 мл. Отберите 1/50 и 1/100 объема лизата для выделения РНК и белка соответственно.

Начните экспресс-процедуру изоляции РНК-белковых комплексов, добавив 300 micrograms авидина к клеточному лизату. Инкубируйте смесь в течение 30 минут при 4 degrees Celsius при постоянном перекатывании. Пока клеточный лизат инкубируется с авидином, проведите предварительную промывку стрептавидиновых бусин: перенесите около 300 microliters суспензии стрептавидиновых бусин в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliters, центрифугируйте препарат, затем удалите верхний супернатант, чтобы получить 250 microliters бусин.

Добавьте 1 milliliter буфера для быстрого лизиса к гранулам и центрифугируйте при 660 ×g в течение 2 минут при 4 °C. Удалите супернатант и повторно промойте гранулы буфером для быстрого лизиса. Для блокировки гранул добавьте 0.5 milliliters буфера для быстрого лизиса, 0.5 milliliters BSA и 10 µL дрожжевой TRNA, затем инкубируйте в течение 1 часа при 4 °C при постоянном вращении.

Промойте гранулы дважды 1 миллилитром буфера для быстрого лизиса. Добавьте 250 микролитров предварительно промытых стрептавидиновых гранул к лизату, содержащему авидин, и инкубируйте в течение 1 часа при 4 градусах Цельсия при постоянном вращении. Данное время инкубации является компромиссом между обеспечением достаточного времени связывания и минимизацией вероятности деградации РНК.

Через один час центрифугируйте при 660 ×g в течение 2 минут при 4 °C для осаждения стрептавидиновых бусин. Перенесите супернатант в пробирку объемом 15 мл. Отберите 1/50 и 1/100 объема лизата для выделения РНК и белка соответственно.

Добавьте 1 мл буфера для быстрого лизиса к гранулам. Перемешайте путем пипетирования, перенесите в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 660 ×g в течение 2 минут при 4 °C. Промойте еще три раза буфером для быстрого лизиса.

После финальной промывки буфером для быстрого лизиса удалите супернатант, добавьте 1 milliliter буфера для быстрой промывки и перемешивайте в ротаторе в течение 5 минут при 4 degrees Celsius. Центрифугируйте и промойте еще 2 раза буфером для быстрой промывки. Промойте гранулы 1 milliliter PBS и центрифугируйте, как указано ранее.

Удалите супернатант, добавьте к гранулам 120 µL PBS и перемешивайте в ротаторе в течение 5 минут. Центрифугируйте, как и ранее, и соберите весь супернатант в качестве промывочного образца для экстракции РНК и белков. Для элюции РНК и ассоциированных с ней белков добавьте к гранулам 120 µL 6 mM биотина в PBS и инкубируйте в течение 45 минут при 4 °C при постоянном вращении.

Центрифугируйте гранулы и перенесите элюированный материал в новую пробирку объемом 1,5 мл. Повторно центрифугируйте элюированный образец и перенесите верхнюю фазу в новую пробирку объемом 1,5 мл, чтобы исключить перенос гранул. Возьмите пробы для экстракции РНК или белков.

Для определения эффективности выделения и качества РНК был проведен нозерн-блот-анализ двух меченых РНК — PMP1 и FPR1, полученных при обычном лизисе клеток, экспресс-лизисе клеток, а также после элюции биотином. Рибосомальные РНК были выявлены путем окрашивания бромистым этидием; отсутствие рибосомальных РНК в элюированном образце свидетельствует о высокой степени чистоты очистки.

Строгость и специфичность очистки дополнительно подтверждаются отсутствием сигнала немеченой MRNA в образцах элюата. Видимый сигнал в дорожке FPR1, размер которого не соответствует ACT1, является остатком от предыдущей гибридизации с зондом MS2L. Несмотря на то, что исходная РНК несколько более деградирована по сравнению с РНК, очищенной по протоколу с горячим фенолом, значительное количество полноразмерной меченой РНК изолируется специфически, о чем свидетельствует сильный сигнал в фракциях элюата.

Образцы белков перед протеомным анализом можно исследовать с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром. Слитой белок MS2-CP-GFP-SBP, отмеченный стрелкой, свидетельствует о равной загрузке белка. Звездочками отмечены полосы с различной интенсивностью, которые впоследствии были вырезаны из геля для масс-спектрометрического анализа.

При выполнении данной процедуры важно использовать перчатки, обеспечить чистоту рабочей зоны, готовить растворы с использованием воды, свободной от РНК, а также работать быстро и четко, чтобы сократить время выполнения протокола. Не забывайте, что работа с такими реагентами, как фенол и формальдегид, может быть крайне опасной, поэтому при проведении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, например, работать в вытяжном шкафу. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как эффективно и качественно очищать РНК fayn-tress и связанного с ним тела.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как RNA-Seq, для обнаружения РНК, связывающихся с исследуемым транскриптом.