"Фагосоме Закрытие Анализ" для визуализации фагосоме Формирование в трех измерениях с помощью полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM)

Общая цель данного протокола — визуализировать формирование фагосомы, а также точное место разделения фагосомы в 3D в живых макрофагах с помощью микроскопии полного внутреннего отражения, или TIRF-микроскопии. Этот метод сочетает TIRF-микроскопию с эпифлуоресценцией для пошагового мониторинга локализации двух различных флуоресцентных белков во время вытягивания псевдоподий и слияния их кончиков. Данная методика представляет собой систематический способ определения критического угла и получения TIRF-сигнала, что крайне важно для формулирования выводов о процессах, происходящих в непосредственной близости от плазматической мембраны.

За день до сеанса работы с TIRF-микроскопом включите нагревательную камеру при 37 °C для обеспечения равномерного прогрева предметного столика микроскопа. На следующее утро, используя 100 µL PBS с добавлением 0,1% BSA, дважды промойте 7x10⁶ эритроцитов овцы (SRBC) в чашке с This стеклянным дном диаметром 35 мм. После второго центрифугирования ресуспендируйте клетки в 500 µL rabbit IgG anti-SRBC в PBS с добавлением 0,1% BSA в субагглютинирующей концентрации (из расчета 5 µL клеток) и инкубируйте клетки в течение 30 минут при медленном перемешивании.

По окончании инкубации дважды промойте эритроциты кролика (SRBCs) в PBS с BSA, а затем ресуспендируйте клетки в 2 миллилитрах безсывороточной микроскопической среды с температурой 37 °C на одну чашку. Затем обработайте 35-миллиметровые чашки с стекнированным дном 2 миллилитрами 0,1% поли-L-лизина в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего дважды промойте их 2 миллилитрами PBS. Для нековалентной фиксации SRBCs внесите по 2 миллилитра клеток, опсонизированных IgG, в каждую чашку, покрытую полилизином, и центрифугируйте образцы в центрифуге с поворотным ротором.

Удалите супернатанты и один раз промойте частицы 2 миллилитрами PBS с добавлением 10% BSA. Затем инкубируйте частицы в 2 миллилитрах свежего PBS с 10% BSA в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего проведите три промывки 2 миллилитрами PBS. После последней промывки замените PBS на 2 миллилитра безсывороточной микроскопической среды, подогретой до 37 °C.

Поместите чашку, покрытую SRBC, на предметный столик микроскопа. Затем соскребите трансфицированные исследуемые клетки со дна культуральной чашки и несколько раз пропипетируйте их для получения суспензии одиночных клеток. Добавьте трансфицированные клетки в чашку, покрытую SRBC.

Запустите программное обеспечение для захвата изображений в режиме реального времени. Найдите клетку, экспрессирующую флуоресцентно меченные белки, и отрегулируйте положение планшета так, чтобы интересуемая клетка находилась в центре поля зрения. Получите 500 изображений под разными углами от 0 до 5% с шагом 0,01 градуса при одной длине волны возбуждения.

Чтобы определить критический угол падения света, при котором происходит полное внутреннее отражение на границе раздела стекло-среда и возникает затухающая волна, откройте последовательность изображений в соответствующем программном обеспечении для анализа изображений. Выберите область интереса в кювете с равномерной флуоресценцией. Затем на вкладке Image выберите Stacks, а затем Plot Z Axis Profile.

Для построения графика зависимости средней интенсивности флуоресценции профиля по оси z, измеренной в области интереса, от значений углов на оси x. Любое значение угла на оси x, превышающее критический угол, может затем быть использовано во время сеанса микроскопии для получения сигнала TIRF. Затем в программном обеспечении для сбора данных в режиме реального времени используйте редактор протоколов для настройки параметров сбора данных.

Укажите количество циклов сбора данных, флуоресцентные каналы и интенсивность лазерного излучения для каждого из них, угол TIRF и время экспозиции. Переместите объектив по оси Z так, чтобы достичь плоскости режима эпифлуоресценции. Затем в режиме эпифлуоресценции установите угол TIRF на 1 и верните объектив по оси Z в плоскость TIRF.

Затем получите изображение клетки в режиме яркого светодиодного освещения. Найдите интересующую вас клетку с умеренным уровнем экспрессии белка с флуоресцентной меткой, вступающую в фагоцитоз с SRBC, и переместите ее в центр поля зрения. Обратите внимание, что такую клетку можно идентифицировать по вытянутой плазматической мембране вокруг частицы.

Введите количество кадров на вкладке Loop Count, чтобы начать потоковый сбор данных от 500 до 1 000 кадров. При необходимости измените интенсивность лазера и время экспозиции, чтобы адаптироваться к различным уровням флуоресценции в клетке. Чтобы создать две отдельные последовательности изображений, соответствующие двум каналам, откройте последовательности в программном обеспечении Imagine и перейдите на вкладку Image.

В меню Hyperstacks выберите Stack to Hyperstack. Затем в появившемся окне в поле Order введите xyctz, в поле Channels — количество использованных флуорохромов, в поле Slices — число срезов по оси z, в поле Frames — общее число изображений, деленное на количество каналов, а в поле Display Mode выберите Grayscale. После этого выполните разделение каналов.

Здесь представлено репрезентативное видео TIRF-микроскопии живых клеток, демонстрирующее анализ закрытия фагосомы в макрофагах RAW 264.7, поглощающих opsonized SRBC, обработанные IgG. По мере того как кончики псевдоподий вокруг SRBC прижимаются к стеклянному покровному стеклу, в TIRF-зоне обнаруживается кольцо F-актина, которое постепенно сужается до полного закрытия. Параллельно с этим размытый сигнал F-актина, зафиксированный при эпифлуоресцентной микроскопии после смещения предметного столика на три микрона выше TIRF-зоны, соответствует деполимеризации у основания фагоцитарной чаши.

Через три минуты SRBC полностью интернализируется, что подтверждается визуализацией в проходящем свете. С помощью этого метода можно продемонстрировать распределение актина у основания фагоцитарной чаши, где происходит фокальный экзоцитоз внутриклеточных компартментов. После захвата отдельную клетку можно подвергнуть дальнейшей обработке для корреляционной электронной микроскопии, либо всю популяцию клеток можно зафиксировать и подвергнуть заморозке для классической иммунофлуоресцентной микроскопии.

Важно помнить, что фагоцитоз очень чувствителен к температуре, поэтому температура в нагревательной камере и в среде культурального планшета должна поддерживаться на постоянном уровне 37 °C на протяжении всей процедуры. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить опсонизацию частиц, наносить частицы на покровные стекла, определять критические углы для TIRF-микроскопии и визуализировать локализацию интересующих белков в процессе фагоцитоза в живых клетках.