Быстрая и конкретная оценка галогенирующего пероксидазной активности в лейкоцитами обогащается проб крови
28 июля 2016 г.
Этот протокол описывает быстрое обогащение лейкоцитов из небольших образцов крови для последующего специфического определения активности галогенирующей пероксидазы в клетках. Метод может быть применен к человеческому и нечеловеческому материалу и может способствовать оценке новых маркеров воспаления.
Общая цель данного метода обеднения эритроцитами заключается в быстром и простом обогащении лейкоцитами небольшого образца крови. К основным преимуществам этой методики относятся ее дешевизна, надежность и быстрота. Кроме того, она может быть применена к образцам крови как человека, так и животных.
Перед началом процедуры лизиса настройте дозатор для подачи воды на два миллилитра, а дозатор для PBS — на пять миллилитров. Затем поместите открытые флаконы с водой и PBS под ламинарный поток при комнатной температуре. Поскольку гипотонический лизис является процессом, критичным по времени, все необходимое должно быть подготовлено заранее.
Кроме того, процедуру лизиса следует всегда проводить одинаково для обеспечения сопоставимости результатов. Затем перенесите 100 µL из каждого образца крови в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте в каждый образец два мл дистиллированной воды, перемешивая на вортексе при средней скорости.
Оставьте клетки в покое на 60 секунд, затем добавьте пять миллилитров PBS. Перемешайте образцы с помощью вортекса. Теперь осадите клетки центрифугированием и слейте супернатанты.
Переверните пробирки и осторожно постучите по отверстиям, приложив бумажное полотенце, чтобы удалить максимально возможное количество жидкости. Затем повторите процедуру гипотонического лизиса, как было продемонстрировано ранее. После повторного получения сухого осадка ресуспендируйте каждый образец в 500 µL HBSS до получения гомогенного раствора.
Перенесите клетки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл на льду. Чтобы проверить специфичность пероксидазы в образцах после окрашивания аминофенолфлуоресцеином (APF), сначала добавьте 5 µL ингибитора гемопероксидазы 4-ABAH в соответствующие образцы и инкубируйте в течение 15 минут при 37 °C. Затем добавьте 5 µL рабочего раствора APF в каждую пробирку и осторожно перемешайте клетки на вортексе при средних настройках.
Инкубируйте все образцы при 37 °C в течение 30 минут. Затем добавьте по 5 µL рабочего раствора перекиси водорода в каждый образец и осторожно перемешайте пробирки на вортексе. Через 60 минут инкубации при 37 °C центрифугируйте клетки и аккуратно удалите супернатант, не задевая осадок.
Наконец, ресуспендируйте клетки в 250 microliters HBSS и храните образцы в темноте до проведения анализа, чтобы избежать фотовыгорания. Здесь представлен репрезентативный пример популяций лейкоцитов после гипотонического лизиса и окрашивания APF, как было продемонстрировано выше. При построении графика размера клеток в зависимости от гранулярности можно наблюдать значительное удаление эритроцитов, при этом популяция эритроцитов и клеточного детрита составляет всего 22% событий.
Кроме того, распределение интенсивности флуоресценции, производной от APF, позволяет четко дифференцировать пероксидаза-отрицательные эритроциты и лимфоциты, при этом для пероксидаза-положительных моноцитов и эозинофилов наблюдается умеренное окисление APF, а нейтрофилы демонстрируют интенсивное окисление пероксидазы. При должном освоении эта методика может быть применена параллельно для анализа до 50 образцов крови. После данной процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как окрашивание антителами, для идентификации интересующих подмножеств клеток.
После своей разработки этот метод открыл исследователям в области изучения мелких животных возможность изучить роль галогенирующей активности MPO и EPO на животных моделях хронических воспалительных заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан быстрый и простой метод обогащения лейкоцитов из малых образцов крови, применимый как для человеческого, так и для животных материалов. Этот метод является экономически эффективным и надежным, что облегчает оценку новых маркеров воспаления.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Клеточная биология
Введение
- Обогащение лейкоцитов имеет решающее значение для изучения иммунных ответов.
- Традиционные методы могут быть трудоемкими и сложными.
- Данный метод направлен на упрощение этого процесса.
- Он может быть использован как для образцов крови человека, так и для образцов крови животных.
Цель исследования
- Разработать протокол экспресс-обогащения лейкоцитами.
- Оценить активность галопероксидазы в лейкоцитах.
- Внести вклад в идентификацию маркеров воспаления.
Используемые методы
- Подготовка пипеток для введения воды и PBS.
- Использование ламинарного шкафа для обработки образцов.
- Гипотонический лизис для удаления эритроцитов.
- Соблюдение временных интервалов при проведении процедуры лизиса.
Основные результаты
- Успешное обогащение лейкоцитов из малых образцов крови.
- Надежная оценка пероксидазной активности.
- Применимость как для человеческих, так и для животных образцов.
- Возможность оценки новых маркеров воспаления.
Выводы
- Метод является эффективным и экономически выгодным.
- Он расширяет возможности изучения иммунных ответов.
- Данный протокол может быть использован в качестве основы для дальнейших исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет осуществлять быстрый стандартизированный обогащение лейкоцитов из малых образцов крови, что способствует ранним этапам поиска мишеней в исследованиях воспалительных заболеваний. Путем количественного определения галогенизирующей пероксидазной активности MPO и EPO метод обеспечивает механистический анализ для валидации мишеней и снижения рисков при изучении сигнальных путей. Совместимость метода с проточной цитометрией и окрашиванием антителами облегчает его интеграцию в рабочие процессы скрининга и трансляционные исследования.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать специфическую пероксидазную активность лейкоцитов для подтверждения MPO и EPO в качестве терапевтических мишеней при хроническом воспалении.
- Практическая ценность: требует минимального объема образца (50–100 µL), что позволяет проводить повторный забор проб у моделей на мелких животных для лонгитюдных исследований взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: сочетание окрашивания APF с проточной цитометрией позволяет получать количественные показатели продукции HOCl/HOBr на основе флуоресценции для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает высокопроизводительную обработку до 50 образцов параллельно, что позволяет проводить масштабируемые кампании по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Устанавливает связь между активностью лейкоцитарной пероксидазы и патологически значимыми воспалительными процессами, что способствует согласованию биомаркеров в доклинических моделях.
- Практическая ценность: Подходит для работы с кровью как человека, так и грызунов, обеспечивая межвидовую трансляционную преемственность при валидации мишеней.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум исследований — от первоначальной проверки гипотез о мишенях до доклинической валидации, особенно в рамках программ по изучению иммунологии и воспалительных заболеваний.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез путем количественного определения специфической пероксидазной активности ферментов в очищенных популяциях лейкоцитов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты с помощью флуоресценции APF и проточной цитометрии, что позволяет оценивать влияние соединений на активность пероксидазы.
- Аналитика: позволяет получать измеримые данные об интенсивности флуоресценции для сравнения подмножеств пероксидаза-положительных клеток (нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов) в экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают активность пероксидазы с механизмами воспалительных заболеваний, обеспечивая преемственность доклинических исследований при сочетании с окрашиванием на маркеры клеточной поверхности.
- Корпоративное повторное использование: стандартизированное обогащение лейкоцитов и детекция на основе APF формируют универсальную платформу для работы с множеством мишеней воспалительных процессов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет изоляции пероксидазной активности в конкретных линиях лейкоцитов.
- Операционная ценность: предлагает недорогой и быстрый протокол, требующий минимального набора оборудования (центрифуги, вортекса, проточного цитометра).
- Стратегическая ценность: сокращает сроки биологической минимизации рисков, позволяя проводить быструю и итеративную оценку модуляции мишени в образцах лейкоцитов.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации ингибиторов MPO/EPO с учетом рисков за счет получения ранних данных о функциональной активности в физиологически релевантных клетках.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с лейкоцитами, проведение проточной цитометрии и знание химии флуоресцентных зондов.
- Необходимо наличие центрифуг, вортексных смесителей, ламинарных шкафов и проточных цитометров с соответствующими каналами флуоресценции.
- Для получения воспроизводимых результатов требуется стандартизация рабочих растворов APF и перекиси водорода между лабораториями.
- Адаптация метода для видов животных требует подтверждения экспрессии пероксидазы и эффективности окрашивания APF в целевых подмножествах лейкоцитов.
- Метод ограничен определением активности галогенизирующей пероксидазы; другие функции лейкоцитов не измеряются, если метод не комбинируется с дополнительными анализами.
