Развитие более чувствительным и специфичным хромогенного агаровой среде для обнаружения Vibrio parahaemolyticus И другие Vibrio Виды

Общая цель этой процедуры заключается в оценке чувствительности и специфичности новой хромогенной среды для обнаружения и выделения Vibrio parahaemolyticus по сравнению с обычными средами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области пищевой и экологической микробиологии, например, какова распространенность видов Vibrio в пищевых продуктах и местах сбора урожая? Основное преимущество нашей процедуры заключается в том, что можно использовать множество бактериальных изолятов, в том числе и при наличии пищевой матрицы.

Перед культивированием бактерий полностью автоклавируйте все агаровые среды. Затем охладите агар до 45 – 50 градусов Цельсия на водяной бане. Когда агар будет готов, разложите пустые пластины Петри стопками по пять-шесть тарелок.

Затем, начиная со дна стопки, вылейте расплавленный агар в каждую тарелку примерно до половины заполнения, заменив крышки после заливки. Дайте агару застыть при комнатной температуре не менее 12 часов. Для установки культур микробных штаммов, когда агар будет готов, используйте стерильную инокуляционную петлю для переноса культур на соответствующие неселективные агаровые планшеты, нанося полосы на бактерии по схеме, которая позволит наблюдать за изолированными колониями.

Когда все колонии будут покрыты, инкубируйте культуры вверх ногами при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 48 часов, за исключением видов Campylobacter, которые должны инкубироваться в банке с закрытой крышкой, содержащей газовый мешочек, для создания микроаэрофильной среды. Наблюдайте за морфологией колонии в конце инкубации. Чистые культуры должны давать колонии, которые демонстрируют сходную морфологию колоний.

Чтобы вырастить интересующие вас колонии на селективных и дифференциальных средах, пересадите несколько изолированных колоний в пять миллилитров соответствующего бульона и повторно инкубируйте культуры при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 16-24 часов. На следующий день нанесите цикл ночных культур по крайней мере на одну агаровую пластину Тиосульфат-Цитрат-Бил-Соли-Сахароза, или TCBS, и по крайней мере на одну хромогенную агаровую пластину на срок до 96 часов инкубации при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия. В конце инкубации изучите как плотность культуры на планшете, так и размер изолированных колоний, чтобы определить общий рост штаммов, записывая цвет колоний под воздействием окружающего или ультрафиолетового света, в зависимости от обстоятельств, и отмечая любые другие важные характеристики колоний.

Чтобы провести восстановительный анализ, введите молодые культуры Vibrio parahaemolyticus в пять миллилитров триптического соевого бульона, дополненного двухпроцентным хлоридом натрия или TSBS, и поместите пробирки при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия на 16-24 часа. На следующий день свергните ночные культуры и установите один раз по 10 раз к отрицательному, к одному умно-10 к отрицательным семи разведениям бактерий в PBS. Используя разведение по принципу «1 умножить на 10» на «отрицательный» и «умножить на 10» на отрицательные семь разведений, равномерно распределите по 100 микролитров каждого разбавления на отдельные хромогенные, ТКБС и триптический соевый агар с добавлением двухпроцентного агара хлорида натрия или ТСАС.

Инкубируйте все планшеты при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 96 часов. Затем подсчитайте колонии, игнорируя таблички с колониями, на которых их слишком много, чтобы их можно было сосчитать, или на которых меньше 25 колоний. Для проведения конкурентного анализа выбирают штамм V.Parahaemolyticus, который дает ожидаемые колонии turqouise на TCBS и голубые колонии на хромогенном агаре, и не-V.

Вид Parahaemolytius, который не растет ни на одной из сред или имеет другую окраску колоний. Переведите несколько изолированных колоний V.Parahaemolyticus и V.Metschnikovii из сельскохозяйственных колоний TSAS в пять миллилитров TSBS для 16-24-часовой инкубации при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия. Переведите несколько изолированных колоний Shigella sonnei из агара Brain Heart Infusion или BHI в пять миллилитров бульона BHI на 16-24 часа при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия.

На следующий день проведите серийное разведение для каждого штамма, нанося разведения на неселективные агаровые планшеты, чтобы определить колониеобразующие единицы на миллилитр ночных культур. Затем используйте ночные культуры и пробирки для разбавления для смешивания различных объемов штамма V.Parahaemolyticus и не-V. Parahaemolyticus species и распределите 100 микролитров бактериальной смеси на отдельные хромогенные, TCBS и TSAS агаровые пластины.

Через 96 часов при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия подсчитайте колонии на основе их различий в росте и морфологии на хромогенных пластинах и пластинах TCBS. Чтобы оценить влияние гомогенатов устриц на рост бактерий на селективных и дифференциальных средах, сначала взвесьте не менее 50 граммов мяса устриц не менее чем из 12 моллюсков, включая мясо и ликер. Затем добавьте равную массу PBS к тканям устрицы и взбивайте смесь на высокой скорости в течение 90 секунд.

Далее добавьте 100 грамм разведенного гомогената устриц в 400 граммов PBS и взбивайте смесь на высокой скорости в течение одной минуты. Затем автоклавируйте гомогенат. После остывания добавьте по 100 микролитров каждого на ночь V.Parahaemolyticus и non-V.

Парагемолитическое растение культивируют в устричной суспензии и используют гомогенизатор для смешивания бактериальных клеток с гомогенатом устрицы. Сделайте один умножить на 10 на отрицательный один к одному умножить на 10 на отрицательные три разведения гомогената устриц с шипами в PBS, как показано на рисунке, распределив по 100 микролитров каждого разбавления на отдельные хромогенные, TCBS и TSAS планшеты. Через 96 часов при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия сравните фактическое количество колоний на хромогенных и TCBS агарах с ожидаемым количеством колоний, выведенным из стандартного подсчета, проведенного на ночных культурах.

Чтобы определить рост и морфологию колоний штаммов, использованных в этом исследовании, бактерии выращивали на селективных и дифференциальных средах. TCBS является обычной средой, используемой для выделения некоторых видов вибрионов, включая бирюзовый V.Parahaemolyticus и желтый V.Cholerae. Использование хромогенной среды для отбора клинически значимых видов вибрионов из пищевых продуктов и образцов окружающей среды приводит к получению голубого V.Parahaemolyticus и пурпурного V.Cholerae.

Колонии V.Parahaemolyticus, выращенные на хромогенных агаровых пластинах в присутствии гомогената устрицы, наблюдаются в количестве, аналогичном колониям на неселективных средах, что позволяет предположить, что предел обнаружения хромогенной среды аналогичен пределу обнаружения в неселективных средах, даже в присутствии пищевой матрицы. Присутствие не-V также не влияет на рост и восстановление V. Parahaemolyticus. Виды Parahaemolyticus, важный атрибут для дифференциальных и селективных сред, поскольку образцы окружающей среды содержат различные виды вибрионов в больших количествах, особенно после процедуры обогащения.

Кроме того, сравнение TCBS и хромогенных агаров методом термолабильной ПЦР с гемолизином показало более высокую чувствительность и специфичность для хромогенного агара, что указывает на лучшую общую эффективность этой дифференциальной и селективной среды для обнаружения и идентификации V.Parahaemolyticus. После освоения вся процедура, включая тестирование и время инкубации примерно 50 штаммов, может быть завершена в течение 30 дней при правильном выполнении. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательной маркировке всех культур и всегда использовать асептическую технику.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как ПЦР колоний, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например: Несет ли этот конкретный изолят ген вирулентности? После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области безопасности пищевых продуктов и общественного здравоохранения к изучению обнаружения видов вибрионов в моллюсках и окружающей среде эстуариев. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить стандартный подсчет планшетов и как оценивать чувствительность, специфичность и предел обнаружения питательной среды.

Не забывайте, что работа с патогенами и горячей средой может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитной одежды, закрытие любых открытых ран и сортировка биологически опасных отходов.