Методы определения ставок глюкозы и жирных кислот Окисление в изолированной рабочей сердца крысы

Общая цель данной процедуры заключается в одновременном измерении скорости окисления глюкозы и окисления жирных кислот в миокарде, а также сократительной функции сердца в изолированном работающем сердце крысы в режиме реального времени. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистых исследований, например, о том, как сердце метаболически адаптируется к острым изменениям энергетических потребностей и как эти реакции изменяются при патологических состояниях.

Основным преимуществом данного метода является то, что он предоставляет исследователю полный контроль над переменными окружающей среды, такими как природа и концентрация субстратов, лекарственных препаратов или гормонов, подаваемых к сердцу. Демонстрацию проведет Bhavisha Bakrania, постдокторант из центра сердечно-сосудистых ресурсов при Медицинском центре Университета Миссисипи. Для начала запустите насос, чтобы заполнить перфузионный аппарат и насытить буфер кислородом.

После подготовки материалов анестезируйте крысу и подготовьте её к операции. Выбрейте шерсть на животе и выполните срединный разрез с латеральным расширением. Отодвиньте желудок и кишечник в сторону, чтобы получить доступ к нижней полой вене, и введите 200 USP единиц гепарина.

Подождите от 5 до 10 секунд, затем с помощью ножниц разрежьте диафрагму и боковые стенки грудной клетки, чтобы обнажить содержимое грудной полости. Затем осторожно захватите сердце рукой и иссеките сердце и легкие вместе. Выполните разрез на уровне нисходящей аорты, стараясь не повредить при этом дугу аорты и восходящую аорту.

Немедленно перенесите сердце и легкие в чашку для диссекции, наполненную ледяным буфером KH. После того как сердце перестанет биться, научитесь работать быстро, чтобы его можно было запустить снова в течение одной или двух минут. Теперь погрузите сердце и легкие в новую чашку с ледяным буфером KH.

Быстро удалите крупные фрагменты легочной ткани, затем перережьте нисходящую аорту непосредственно над дугой аорты. При выполнении последующих этапов соблюдайте необходимые меры предосторожности при работе с радиоактивными веществами. Далее с помощью пинцета осторожно вскройте аорту и надвиньте сердце на канюлю.

Будьте предельно осторожны, чтобы не пройти канюлей за пределы аорты, так как это может вызвать гипоперфузию сердца и повреждение аортальных клапанов. Теперь зафиксируйте соединение микрозажимом и начните перфузию сердца по методу Лагендорфа. Не спеша закрепите аорту на аортальной канюле с помощью шелковой нити 3 0 и снимите микрозажим.

Затем найдите легочную вену и при необходимости удалите окружающие ткани, не относящиеся к сердцу. Оставьте достаточное количество ткани, чтобы зафиксировать левое предсердие на канюле. Канюлирование левого предсердия является вторым по важности этапом протокола, так как неправильное введение канюли или наличие утечки ослабят сокращения и исказят количественную оценку скорости метаболизма.

Затем подготовьте канюлю для левого предсердия так же, как это было сделано для правой канюли. После этого с помощью пинцета осторожно захватите устье легочной вены и аккуратно надвиньте сердце на предсердную канюлю. Перемещайте ткани по мере необходимости, стараясь не перегибать аорту и не подвергать сердце чрезмерному натяжению.

Затем зафиксируйте канюлю шелковой нитью 3 0. Наконец, откройте линию предсердия, одновременно переключив аортальную линию в рабочий режим. Если из левого предсердия вытекает буфер, закройте линию предсердия и вернитесь в режим Лагендорфа.

Затем наложите дополнительные швы для более надежной фиксации канюли и снова попытайтесь переключиться в рабочий режим. Если эксперимент предполагает прямое измерение функции ЛЖ с помощью катетера, начните с пункции верхушки ЛЖ иглой 26 gauge, введите катетер для измерения давления и объема и совместите его стержень с продольной осью ЛЖ. Затем расположите дистальный электрод E1 чуть ниже аортального клапана, прилегая к эндокардиальной границе, а проксимальный электрод E4 — непосредственно внутри стенки желудочка.

Теперь поместите сердце в камеру с водяной рубашкой и герметизируйте ее. Затем начните мониторинг функциональных параметров в программном обеспечении. Когда базовые параметры будут стабильными в течение как минимум пяти минут, начните запись данных.

Для измерения коронарного кровотока зафиксируйте время, необходимое для сбора 20 мл эффлюента. Затем с помощью трехходового крана наберите в шприц 2 мл эффлюента, а остальную часть удалите. Немедленно перенесите пробу объемом 2 мл в микроцентрифужную пробирку и отберите аликвоту объемом 0,5 мл для определения скорости окисления глюкозы.

Остаток храните на льду. Продолжайте периодически брать пробы коронарного эффлюента, а перед завершением введите 10 µL гипертонического физиологического раствора в предсердную линию. Сделайте это непосредственно перед ее соединением с канюлей.

Используйте ответ на этот болюс для расчета параллельной проводимости с целью точного определения объема сердца. Затем разгерметизируйте камеру сердца и извлеките катетер из LV. После этого срежьте сердце с канюль и поместите его в ледяной буфер KH. Теперь быстро просушите сердце бумажным полотенцем и измерьте его влажный вес.

После взвешивания приступайте к препарированию необходимых образцов ткани, затем заморозьте оставшуюся ткань, используя щипцы, охлажденные на сухом льду. Для подготовки наполните стеклянные сцинтилляционные флаконы одним миллилитром 10x гиамингидроксида. Подготовьте по одному флакону для каждого образца коронарного эффлюента и два флакона для контролей.

Сразу после загрузки пробирки с образцом поместите её непосредственно в заполненную сцинтилляционную пробирку. Для проведения анализа осторожно закройте пробирку резиновой пробкой-втулкой и загерметизируйте её парафильмом. Теперь, используя одномиллилитровый шприц с длинной иглой 23-го калибра, введите 200 µL 60% перхлорной кислоты через резиновую втулку.

Оставьте все пробирки с образцами на ночь. На следующий день осторожно извлеките каждую пробирку с образцом с помощью пинцета и промойте их дно над открытыми флаконами, используя 1 mL сцинтилляционного коктейля, чтобы собрать весь гидроксид гиамина. Затем добавьте в каждый флакон еще 9 mL сцинтилляционного коктейля.

Для определения удельной активности добавьте 0,5 мл буфера для экстракции в два флакона. Тщательно встряхните флаконы и оставьте их отстаиваться минимум на шесть часов перед проведением измерений. Для определения скорости окисления олеата в миокарде сначала подготовьте колонку с анионообменной смолой для каждого образца.

Заполните концы трубок шприцев объемом 3 мл стекловатой. Затем с помощью переносной пипетки добавьте водную суспензию смолы в каждую колонку до отметки 2 мл. После этого промойте смолу, трижды пропустив через каждую колонку 2 мл ультрачистой воды.

Затем поместите сцинтилляционные флаконы под колонки и нанесите на колонки 0,5 мл коронарного эффлюента. Для измерения фона вместо него используйте перфузионный буфер. Теперь последовательно элюируйте колонки 0,5 мл, 1 мл и, наконец, 2 мл ультрачистой воды.

Утилизируйте колонки. Затем добавьте в пробирки 13 миллилитров сцинтилляционного коктейля. Для определения удельной активности добавьте 0.5 миллилитров перфузионного буфера непосредственно в две пробирки, заполненные 13 миллилитрами жидкого сцинтилляционного коктейля.

Интенсивно встряхните флаконы, дайте им отстояться более шести часов и проведите измерения. Сердца были выделены из двух крыс в возрасте 16 недель и подвергнуты различным стрессовым воздействиям. Для одного сердца острое увеличение рабочей нагрузки имитировали путем повышения постнагрузки на 40% и добавления эпинефрина в перфузионный буфер.

Частота сердечных сокращений немедленно увеличилась более чем на 50% при индукции скачка нагрузки. Мощность сердца при скачке нагрузки увеличилась более чем на 40%, что сопровождалось повышением скорости окисления как глюкозы, так и олеата. Относительное увеличение окисления глюкозы по сравнению с исходным уровнем было значительным.

Другое сердце подвергали 15 минутам глобальной ишемии и 30 минутам реперфузии. В этих экспериментальных условиях спустя несколько минут после начала реперфузии восстанавливалось почти нормальное пульсовое давление. В течение 10 минут мощность сердца быстро увеличивалась, превышая значения до ишемии, после чего возвращалась к значениям, близким к исходным.

Это стало результатом усиленного окисления олеата, в то время как окисление глюкозы быстро восстановилось до преишемического уровня активности. После освоения методики изоляция сердца до начала реперфузии в рабочем режиме может быть выполнена менее чем за пять минут при условии правильного проведения процедуры.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализ экспрессии РНК и белков, для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о влиянии препарата или стрессового воздействия на молекулярные сигнальные пути. Не забывайте, что работа с радиоактивными трассерами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, в том числе использовать полный комплект средств индивидуальной защиты.