Обработки изображений G-белком рецептор-опосредованный хемотаксис и его сигнальных событий в нейтрофилами как клетки HL60

Анализы Визуальные хемотаксиса имеют важное значение для лучшего понимания того, как эукариотические клетки контролируют хемоаттрактантных опосредованную миграцию направленной клеток. Здесь мы описываем подробные методы: 1) в режиме реального времени, мониторинга высокого разрешения множественных анализов хемотаксиса, и 2) одновременно, визуализирующих градиент хемоаттрактантных и пространственно-временной динамики сигнальных событий в нейтрофилами как HL60 клеток.

Общая цель этой модели состоит в том, чтобы обеспечить одновременный мониторинг нескольких анализов хемотаксиса или визуализацию множественных сигнальных событий одной хемотаксирующей клетки. Клеточные биологи Овердека разработали несколько различных подходов к количественной оценке хемотаксисного поведения клеток. До недавнего времени мы могли ответить на ключевые вопросы в области хемотаксиса, такие как одновременный мониторинг нескольких анализов хемотаксиса.

Основное преимущество этой технологии заключается в применении принципа микрофлюидики для получения высоковоспроизводимых и надежных ингредиентов для нескольких одновременных анализов хемотаксиса с высоким разрешением в режиме реального времени. Демонстрировать процедуру будет доктор Си Вэнь, постдок из нашей лаборатории. Чтобы собрать держатель, сначала с помощью рычагов расположите основание в вертикальном положении, чтобы рычаги могли наклоняться в сторону пользователя.

Затем кратковременно покройте поверхность 41-миллиметрового стекла 70% этанолом и с помощью салфетки тщательно удалите этанол. Вставьте стакан в основание держателя и поместите сверху на стекло 2-миллиметровую квадратную крышку с покрытием BSA. Затем вставьте небольшое уплотнительное кольцо в нижнюю часть корпуса пластины и установите корпус пластины в основание держателя с эллиптическим отверстием в задней части прибора.

Потяните внутренний уровень основания держателя вперед в горизонтальное положение, чтобы зафиксировать корпус пластины на месте. Используйте воздушную тряпку, чтобы сдуть любой мусор с внутренней части корпуса пластины. Затем добавьте в корпус 4 миллилитера среды RPMI 1640 с добавлением 0,1% BSA.

Теперь установите микросхему устройства анализа подвижности ячеек с покрытием BSA в центр корпуса пластины так, чтобы структурная поверхность соприкасалась со стеклом, а позиционная метка находилась сзади. Вставьте два выступа на резиновой прокладке в отверстия, чтобы прикрепить прокладку к нижней части межфланцевого зажима, и установите большое уплотнительное кольцо на верхнюю часть корпуса пластины. Затем установите межфланцевый зажим так, чтобы отверстие для датчика находилось сзади, и потяните внешний рычаг основания корпуса вперед в горизонтальное положение, чтобы зафиксировать межфланцевый зажим на месте.

Когда держатель будет собран, поместите дно держателя на световой короб, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в лунках. Затем снимите крышку, перенесите узел на пластину в верхней части блока устройства анализа подвижности ячеек и прикрепите блок датчиков к держателю. Для проведения анализа подвижности клеток сначала суспендируют дифференцированные клетки HL60 в среде с добавлением БСА RPMI 1640 и в концентрации от двух до десяти до шестой клетки на миллилитр.

Затем подключите устройство анализа подвижности клеток к компьютеру для получения изображения и включите оба устройства. Затем откройте программное обеспечение устройства для анализа подвижности клеток. На панели управления изображением камеры используйте горизонтальные и вертикальные линии, чтобы отрегулировать положение держателя в режиме реального времени, и центрируйте устройство на панели изображения камеры.

Затем выберите «Первый канал», чтобы переместить камеру к выбранному каналу, и используйте команду «Переместить влево» или «Переместить вправо», чтобы отрегулировать координату X камеры так, чтобы горизонтальное центрирование поля обзора было по горизонтали. Чтобы отрегулировать изображение по вертикали по центру экрана, поверните ручку положения на передней панели устройства для анализа подвижности клеток. На панели управления обогревателем установите температуру держателя на 37 градусов Цельсия, а температуру пластины на 39 градусов Цельсия.

Чтобы контролировать температуру с помощью термодатчика, подключенного к держателю, нажмите «Нагрев», чтобы начать нагрев, а затем «Держатель». На панели съемки введите 15 секунд для параметра Интервал и 30 минут для параметра Время, чтобы задать интервалы и продолжительность анализа хемотаксиса соответственно. В целях безопасности выберите опцию Обогреватель выключен в конце окна съемки.

Затем сохраните файл, введите особенности эксперимента в панель заметок и подтвердите, что устройство было центрировано по всем каналам. Теперь извлеките весь буфер из держателя, а восемь микролитров буфера из третьей лунки с верхней части первого канала. С помощью шприца ввести два микролитра клеток во вторую лунку в том же канале, при этом контролируя экран в режиме реального времени, чтобы контролировать количество клеток и поток во время инъекции.

Когда ячейки выровнены, немедленно добавьте обратно восемь микролитров буфера в лунку и повторите инъекцию клеток в каналы со второго по шестой, как показано выше. После того, как все ячейки будут добавлены, добавьте два миллилитра буфера обратно в держатель и добавьте один микролитр хемоаттрактанта в третью лунку сверху в соответствующих каналах. Наконец, начните получение изображения.

В этом репрезентативном эксперименте клетки HL60 начинают хемотаксирование по прямой траектории сразу после введения хемоаттрактанта и продолжаются в течение всех 60 минут анализа, что согласуется с результатами моделирования градиентной стабильности. Отслеживание пути передвижения и морфологии клеток позволяет количественно измерить и впоследствии сравнить поведение хемотаксиса с использованием индекса хемотаксиса, который включает общую длину пути, направленность, скорость и округлость клеток. Применение флуоресцентного красителя в сочетании с хемоаттрактантом позволяет установить линейную зависимость между концентрацией хемоаттрактанта и контролируемой интенсивностью флуоресцентного красителя.

Кроме того, в ответ на равномерно применяемую стимуляцию хемоаттрактантом клетки HL60 опосредуют устойчивую мембранную транслокацию тактовой протеинкиназы GFP D1.In градиент хемоаттрактанта, клетки HL60 активно рекрутируют киназу в заднюю часть переднего края. После освоения этот процесс может быть завершен за 30 минут при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру важно строго следовать инструкциям производителя на сборке держателя и следить за инъекцией клетки.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области хемотаксиса к изучению возможности множественных анализов хемотаксиса, таких как моногенизм dictyostilium или другие типы клеточных систем млекопитающих. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собрать устройство, выполнить одновременные анализы хемотаксиса или одновременно визуализировать несколько сигнальных событий в хемотаксирующих клетках.