Углубленный Физиологический анализ клеточных популяций Defined при остром Tissue Ломтики Мыши вомероназальные органа

Общая цель этой процедуры заключается в проведении электрофизиологического анализа одной клетки определенной популяции сенсорных нейронов в острых срезах тканей вомероназального органа мыши. Этот метод может помочь пролить свет на ключевые вопросы в области хемочувствительности, такие как механизмы обнаружения химических веществ «невидимых веществ». Основное преимущество этой методики заключается в том, что путем записи с сенсорных нейронов в острых срезах тканей эти клетки могут быть исследованы в их естественной среде.

Чтобы начать эту процедуру, принеся животное в жертву, удалите его нижнюю челюсть, вставив пару больших хирургических ножниц через ротовую полость, и разрежьте кости нижней челюсти и мышцы с каждой стороны отдельно. Затем удалите кожу верхней челюсти и вокруг кончика носа средними щипцами, чтобы получить лучший доступ к резцам. Затем с помощью костных ножниц отрежьте наибольшую часть резцов под углом 45 градусов в ростральном направлении, чтобы облегчить удаление капсулы VNO из носовой полости.

Не режьте корень зуба, чтобы не повредить кончик капсулы VNO. После этого захватите жесткое верхнее небо в его ростральной части средними щипцами и осторожно отсоедините его от одного куска под плоским углом. Многократно промойте наморочную полость ледяным раствором S2. Затем с помощью ножниц с микропружинами разрежьте костный выпот между кончиком сошника и челюстью.

Вставьте кончики ножниц изогнутой частью, направленной в сторону от VNO. И аккуратно разрезать кость небольшими шагами как с левой, так и с правой стороны, сбоку от капсулы ВНО. Чтобы удалить капсулу VNO, разрежьте кость сошника в каудальной части и осторожно поднимите кость сошника из носовой полости с помощью щипцов среднего размера.

Немедленно перенесите ВНО в маленькую чашку Петри под стереомикроскопом на пакете со льдом, где следует выполнить оставшиеся этапы диссекции. Далее промойте VNO в небольшом количестве ледяного S2, чтобы предотвратить высыхание ткани. Затем отделите хрящевые капсулы, которые содержат мягкие ткани VNO, захватив заднюю часть кости сошника щипцами среднего размера.

Для этого расположите капсулу для дорсального обзора так, чтобы стало видно разделение между обоими VNO. Используйте кончик тонких щипцов, чтобы отделить обе хрящевые капсулы VNO от центральной кости, сохраняя при этом сошниковую кость прижатой к задней части. Убедитесь, что медиальная хрящевая стенка, которая ранее была прикреплена к сошниковой кости, удалена.

При удалении хряща вокруг ВНО используйте щипцы только по краю хрящевой капсулы. И будьте очень осторожны, чтобы не повредить нежный сенсорный эпителий. Чтобы удалить остатки хряща, поверните ВНО изогнутой боковой стороной на дно посуды и надежно прижмите хрящ с одной стороны с помощью щипцов.

Затем осторожно переместите вторые тонкие щипцы с тыльной стороны под очень плоским углом между хрящом и VNO, чтобы ослабить связь между тканью и хрящом. Чтобы избежать повреждения сенсорного эпителия, медленно отслаивайте ВНО от хряща, удерживая его на каудальном кончике. После того, как VNO будет отсоединен от капсулы, удалите все оставшиеся мелкие части хряща, так как любые оставшиеся кусочки хряща отделят ткань от окружающей агарозы в процессе нарезки.

Затем поместите небольшую каплю ледяного S2 на первый рассеченный VNO, чтобы предотвратить повреждение тканей. Чтобы встроить VNO, заполните обе маленькие чашки Петри до края расплавленным S3. После этого погрузите каждый VNO в агарозу и несколько раз переместите его горизонтально вперед и назад, чтобы удалить с его поверхности пленку внеклеточного раствора, а также любые пузырьки воздуха. Расположите VNO вертикально, ростральным кончиком к дну тарелки.

Впоследствии поместите обе посуды на пакет с гелевым льдом и подождите, пока агароза застынет. Не изменяйте ориентацию VNO после того, как агароза начала затвердевать, так как это приведет к отделению ткани от окружающей агарозы. В этой процедуре с помощью небольшого шпателя удалите агарозный блок из маленькой чашки в крышку большой чашки Петри и переверните агарозу вверх дном, оставив ростральный кончик VNO обращенным вверх.

Затем разрежьте блок в пирамидальную форму с помощью хирургического скальпеля, и следите за тем, чтобы не повредить внедренную ткань. Затем с помощью суперклея закрепите блок в форме пирамиды к центру вибратомной пластины образца. И подождите около минуты, чтобы клей полностью высох.

Нарежьте образец на участки толщиной от 150 до 200 микрометров. Кратко осмотрите морфологию среза под препарирующим микроскопом. Затем переложите все ломтики в кислородную камеру до использования.

На этом этапе перенесите срез VNO в камеру визуализации и зафиксируйте положение среза с помощью анкера из нержавеющей стали, смонтированного синтетическими волокнами толщиной в один милометр. Не закрывайте срез ткани нитями синтетического волокна. Затем перенесите камеру визуализации в записывающую установку и непрерывно переливайте срез насыщенным кислородом S2 при комнатной температуре.

Отрегулируйте всасывающий капилляр к поверхности раствора, чтобы создать постоянный обмен раствора для ванны. Затем отрегулируйте многоствольный карандаш «восемь в одном» выше и рядом с несенсорной частью среза VNO, которая содержит кровеносный сосуд. После этого соедините электрод сравнения и раствор ванны с помощью L-образного агарового моста, заполненного 150 миллимолярным хлоридом калия.

Впоследствии заполните патч-пипетку раствором пипетки S4. Установите пипетку на электрод с покрытием из хлорида серебра, подключенный к головному столику, не соскребая покрытие, и надежно закрепите. Затем слегка надавите на патч-пипетку перед входом в ванну. Следите за работой пипетки и убедитесь, что она находится в диапазоне от четырех до 10 мегаом.

Визуализируйте срез VNO с помощью ПЗС-камеры с помощью инфракрасной оптимизированной ДВС-диаграммы и определите экспрессирующие FPR-rs3 i-Venus клетки или аналогично помеченные нейроны с помощью флуоресцентного освещения и соответствующего фильтрующего куба. Подойдите к корпусу клетки с помощью маховиков для максимальной чувствительности. Из-за положительного давления небольшая вмятина на клеточной мембране сомы становится видимой, как только наконечник пипетки находится в непосредственной близости.

Затем отпустите положительное давление и приложите небольшое отрицательное давление, чтобы всасывать клеточную мембрану, чтобы получить высокопрочное уплотнение от одного до 20 гигаом. Затем примените короткое и мягкое отсасывание, чтобы нарушить клеточную мембрану и создать конфигурацию всей клетки. На этом рисунке конфокальное изображение среза ткани коронального VNO показывает распределение флуоресцентных позитивных нейронов FPR-rs3 Tau Venus в вомероназальном сенсорном эпителии.

Положительные нейроны FPR-rs3 Tau Venus демонстрируют один апикальный дендрит, заканчивающийся бугорчатой структурой на просветной границе. И здесь показаны все записи клеточного патч-клэмпа, выполненные с сомы VSN. Вот репрезентативные следы из оптовых записей патч-клещей чувствительного TTX быстро активирующегося натриевого тока и положительных VSN FPR-rs3.

Регистрация шага напряжения в контролируемых условиях показывает зависящий от напряжения быстрый и переходный входящий ток. Лечение TTX на одном микромоляре сильно уменьшает ток. А показанная здесь кривая с цифровым вычитанием показывает чувствительный к напряжению TTX стробированный натриевый ток.

Репрезентативные кривые токовых клещей показывают деполяризацию и гиперполяризацию, а также последовательности потенциалов действия, генерируемых при ступенчатой подаче положительного и отрицательного тока. После освоения весь процесс рассечения и среза тканей может быть выполнен примерно за один час для обоих VNO. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как внеклеточные записи свободных участков или визуализация кальция, чтобы увеличить пропускную способность при анализе больших популяций нейронов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как делать острые срезы тканей из ротового вомероназального органа, и как выполнять электрофизиологические записи одиночных клеток с вомероназальных сенсорных нейронов.