Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Общая цель данного протокола аффинного захвата заключается в выделении эндогенных белковых комплексов из клеток млекопитающих. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной и молекулярной биологии, например, какие белки формируются вместе в физически связанные функциональные модули. Основное преимущество этого метода заключается в том, что многочисленные физические взаимодействия, связанные с интересующим белком-мишенью, могут наблюдаться одновременно.

Вырастите от одного до восьми граммов клеток, как описано в текстовом протоколе. Слейте питательную среду в большой стакан. Затем поместите тарелку для культуры на лед в большую прямоугольную кастрюлю для льда.

Добавьте 20 миллилитров ледяного 1x фосфатно-солевого буфера, или PBS, в чашку для культур и освободите клетки из чашки с помощью скребка для больших клеток. Переложите клетки в 50 миллилитровую пробирку, предварительно охлажденную на льду. Добавьте в ту же посуду еще 10 миллилитров ледяного 1x PBS.

Соберите оставшиеся клетки и перенесите их в 50-миллилитровую трубку. Повторите этот процесс для каждого блюда. Клеточные суспензии из разных чашек могут быть объединены для уменьшения количества образцов и пластиковых отходов.

Затем центрифугируйте образцы в течение пяти минут при температуре 1000 x g при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования осторожно слейте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте каждую гранулу в десяти миллилитрах ледяного 1x PBS.

Консолидируйте ресуспендированные гранулы в количестве до пяти на 50 миллилитровую трубку. Промойте пустые тюбики 10 миллилитрами PBS. Добавьте раствор в консолидированные образцы и центрифугируйте как раньше.

После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах ледяного 1x PBS. Извлеките поршень из шприца объемом 20 миллилитров и отложите его в сторону. Закройте крышку насадки шприца, поместите шприц внутрь трубки объемом 50 миллилитров и перенесите туда клеточную суспензию.

Центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 1000 x g, четыре градуса Цельсия. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки с тонким наконечником, прикрепленной к вакуумной системе ловушек, до тех пор, пока верхний слой клеток не начнет всасываться. В результате получается гранула с влажными ячейками.

Откройте крышку шприца, вставьте поршень и капните клетки прямо в большой пластиковый стакан, наполненный жидким азотом, который находится в ванне с жидким азотом в пенопластовой коробке. Принудительно вонзают оставшиеся клетки из шприца. Далее застывшие клетки разлить по 50 миллилитровым пробиркам.

Неплотно закройте трубки, чтобы лишний жидкий азот испарился. Подержите их на ночь при температуре 80 градусов по Цельсию. Полностью закрутите колпачки на следующий день.

Замороженные клетки могут храниться таким образом при температуре 80 градусов Цельсия до криофрезерования. Достаньте шарики из морозильной камеры с температурой 80 градусов Цельсия и поместите их в держатель пробирки объемом 50 миллилитров в ванну с жидким азотом. Предварительно охладите 50-миллилитровую банку, два 20-миллиметровых шарика и крышку банки в чистом прямоугольном ведре со льдом, содержащем жидкий азот.

Кроме того, предварительно охладите изолятор из ПТФЭ. Используйте либо набор шайб, либо рукав с шайбой. Установите соответствующий противовес на мельнице.

С помощью щипцов поместите два предварительно охлажденных 20-миллиметровых мельничных шара и замороженные ячейки в предварительно охлажденную банку для помола. Добавьте в банку жидкий азот до половины заполненной, накройте банку крышкой и перенесите сборку на мельницу. Зажмите узел на месте и выполните три цикла фрезерования, используя программу 400 об/мин, три минуты, обратное вращение каждую минуту и без перерыва между интервалами.

Критично слышать дребезжание шариков во время фрезерования, это говорит о том, что шарики сталкиваются и измельчают материал. Если вы не слышите этот звук, это означает, что фрезерование не происходит. По завершении трех циклов измельчения переместите банку обратно в жидкий азот и дайте ей немного остыть.

Осторожно снимите крышку. Извлеките шарики с помощью щипцов и переложите порошок в предварительно охлажденную 50-миллилитровую трубку с помощью предварительно охлажденного шпателя. Обратите внимание, что добавление жидкого азота в банку может помочь выбить прилипший на шарики порошок.

Для приготовления клеточного экстракта взвесьте 100 миллиграммов клеточного порошка в предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 или два миллилитров. Спарьте аналитические весы с пустой микрофуговой пробиркой. Выдавите порошок ячейки в пробирку с помощью охлажденной жидким азотом ложки или шпателя.

Проверьте массу порошка, дозированного внутри пробирки, на аналитических весах, прежде чем возвращать пробирку в жидкий азот. Откройте пробирку с порошком и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение одной минуты, чтобы сбросить давление внутри пробирки и предотвратить немедленное замерзание буфера для экстракции при добавлении в порошок. Добавьте в тюбик 400 микролитров экстрагента, дополненного ингибиторами протеазы.

трубку, а затем задержитесь на льду. Используйте ультразвуковой аппарат с микронаконечником, чтобы дать образцу короткий импульс с низким энергопотреблением и диспергировать любые агрегаты. Осветите экстракт центрифугированием.

Наконец, удалите надосадочную жидкость и приступайте к аффинити-захвату. Чтобы предварительно промыть аффинную среду, поместите на магнит пробирки, содержащие парамагнитные шарики, связанные с антителами. В течение нескольких секунд шарики накапливаются на боковой стороне пробирки, что позволяет удалить раствор для хранения.

Затем добавьте в гранулы 500 микролитров экстракционного буфера. Кратковременно переведите вихрь на средней скорости для перемешивания. Прусе вращайте пробирки в мини-центрифуге, чтобы собрать все содержимое на дно пробирки.

Затем поместите трубки на магнит и отсасывайте раствор. Инициируйте аффинный захват, кратковременно перенеся экстракт осветленных клеток в пробирки, содержащие предварительно промытую аффинную среду и вихрь. Инкубируйте пробирки в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия с непрерывным бережным перемешиванием на вращающемся колесе.

Бусины должны оставаться подвешенными на протяжении всей инкубации. Отсадите надосадочную жидкость и трижды промойте шарики одним миллилитром буфера холодной экстракции. Чтобы элюировать белки, добавьте буфер для образца страницы SDS без восстановителя, чтобы смягчить высвобождение цепей антител из гранул.

Выдерживать от пяти до десяти минут при комнатной температуре с перемешиванием. Соберите и сохраните надосадочную жидкость, затем подвергните образцы SDS, а затем окрашивайте белки с использованием стандартных методов. Отдельные белковые полосы могут быть иссечены для идентификации, или весь образец может быть охарактеризован в одном анализе путем электрофорирования образца только на короткое время.

Материал, содержащий нерастворимую среду, используемую для аффинного захвата, может влиять на восстановленный протеом. Здесь представлены магнитные бусины, агароза, пропитанная железом, и традиционная агароза. Каждая среда была соединена с антителами против FLAG M2 и использовалась для захвата меченной FLAG бактериальной щелочной фосфатазы, добавленной в экстракты, полученные из криомиллированных клеток HEK 293.

Магнитные шарики микронного масштаба показали наиболее чистый профиль, что указывает на относительно низкий уровень адсорбции неспецифических белков. Метод лизиса клеток также может воздействовать на восстановленный протеом. Здесь эндогенный белковый комплекс был подвергнут аффинному захвату из криомольированных или обработанных ультразвуком клеточных экстрактов.

Меньшее количество загрязняющих веществ с высокой массой наблюдалось при производстве клеточного экстракта из криомолотого клеточного порошка. Несмотря на то, что магнитные среды могут иметь более низкий фон, чем другие среды, само антитело может способствовать адсорбции ложноположительного загрязнения, особенно в отсутствие его целевого антигена. Для определения фонового связывания, вносимого магнитной средой против FLAG, когда паратопы антител заняты или не заняты, были проведены эксперименты по имитационному захвату аффинности с использованием экстрактов клеток HEK 293T в присутствии или отсутствии 3-кратного пептидного всплеска FLAG.

В отсутствие родственного эпитопа среда альфа FLAG захватывает обнаруживаемый уровень фоновых белков, которые могут быть конкурентно ускользают с помощью 3-кратного пептида FLAG и в большей степени ускользают от буфера образца страницы SDS. Доминирующий вид загрязняющих веществ наблюдался в диапазоне от 37 до 50 килодальтонн. В присутствии конкурирующего эпитопа элюции на основе 3x FLAG и SDS сравнительно свободны от фонового связывания с белками.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно работать аккуратно, быстро и точно. Отслеживайте свои процедуры и любые наблюдаемые изменения, чтобы узнать, какие шаги наиболее важны для ваших результатов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как масс-спектрометрия, скоростно-зональное центрифугирование и электронная микроскопия, для анализа состава смеси, уровня ее однородности, а также размера и формы составляющих макромолекулярных комплексов.

После своего развития аффинити-захват проложил путь исследователям в области протеомики к изучению составов физиологических белковых комплексов с беспрецедентной детализацией, что до сих пор является непрерывной глобальной исследовательской работой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить клетки млекопитающих к криофрезерованию и как выполнить аффинный захват интересующего вас белка.