Доставка нуклеиновых кислот через Эмбрион микроинъекции в во всем мире насекомых-вредителей сельского хозяйства, Ceratitis capitata

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы доставить нуклеиновые кислоты в эмбрионы Ceratitis Capitata, важного сельскохозяйственного вредителя, чтобы в конечном итоге расширить набор инструментов для борьбы с ним. Этот метод помогает функционально корригировать гены в иммобилизованном организме, а также генерировать трансгенные штаммы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что для достижения желаемого эффекта вводится очень небольшое количество нуклеиновых кислот.

Поддерживайте все жизненные стадии колонии медушек при температуре 25 градусов Цельсия при влажности 65% и 12-часовом фотопериоде свет/темнота с фотофазой, начинающейся в 8 часов утра. Вставьте полоску губки через небольшое отверстие в основании клетки, чтобы обеспечить мух водой с помощью капиллярного действия. Вы устанавливаете шестилитровую клетку, загружаете одну от 1 500 до 2 000 куколок.

Для еды загрузите в клетку около 45 граммов смеси дрожжей и сахара от одного до 10. Чтобы собрать яйца, поставьте под клетку тарелку, наполненную водой. Самки будут откладывать икру через сетку, которая затем будет собираться в воде.

Поскольку девственные самки могут откладывать яйца, убедитесь, что все яйца оплодотворены, дождавшись, пока мухам исполнится хотя бы неделя, прежде чем собирать яйца. Чтобы собрать яйца, процедите воду с помощью мелкодисперсного фильтра. Затем с помощью пастериальной пипетки переложите яйца в пластиковый ящик, загруженный примерно 0,5 литрами стандартного корма для личинок.

Если яиц было снесено недостаточно, то увеличьте содержание дрожжей в пище взрослой особи до 25%. Поместите каждый ящик в прозрачную емкость, содержащую слой отрубей для благоприятного окукливания. Накройте контейнер сетчатой крышкой, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха. Примерно через 10 дней проверьте, нет ли личинок третьего возраста, которые спрыгнули вниз в слой отрубей для окукливания.

После того, как вы найдете, приготовьтесь к проверке на наличие куколок в следующие дни. Чтобы собрать куколок, с помощью мягкой щетки выметите их из контейнера. Изначально соберите куколок в небольшую чашку.

После того как сборы будут завершены, пересадите куколок в новую клетку для взрослых особей. Взрослые особи должны появиться примерно через 10 дней. Для микроинъекции заранее подготовьте предметные стекла.

Прикрепите двухсантиметровую полоску ленты с двойным покрытием к предметному стеклу и отметьте края китайским маркером, чтобы получилась стенка для масляного слоя, который сохраняет эмбрионы увлажненными. Чтобы собрать только что заложенные эмбрионы, дайте молодым оплодотворенным самкам в течение 30 минут отложить яйца на новом лотке, а затем соберите эмбрионы. Чтобы удалить хорион из эмбрионов, опустите ситечко и яйца в коммерческий 50% раствор отбеливателя на пять секунд.

Очень важно не переусердствовать с обесцвечиванием эмбрионов. Немедленно промойте обесцвеченные эмбрионы, осторожно опустив ситечко в чистую сверхчистую воду. Сделайте это не менее четырех раз.

Затем держите ситечко в прозрачной ультрачистой воде и вводите эмбрионы в течение двух часов. Далее с помощью тонкой кисти соберите около 50 эмбрионов и поместите их на диск из черной фильтровальной бумаги, смоченной водой. Под препарирующим стереомикроскопом выложите эмбрионы на ленту с двойным покрытием подготовленного предметного стекла микроскопа.

Сориентируйте все эмбрионы в одном направлении. Важно осторожно манипулировать эмбрионами, потому что прокалывание оболочки эмбриона кистью может привести к повреждениям, которые снижают выживаемость эмбриона. Теперь покройте зародыши слоем хлор-трифлоро-этоленового масла.

Нефть должна быть ограничена границами из фарфорового маркера. Не выходите за рамки. С помощью микропипетки загрузите в иглу для инъекций несколько микролитров раствора нуклеиновой кислоты в количестве одного-двух микрограммов на микролитр.

Затем подсоедините иглу к аппарату для микроинъекций и установите его так, чтобы он обеспечивал инъекцию в полсекунды при 800 гекто-паскалях, с противодавлением 150 гекто-паскалей. Чтобы сделать инъекцию, используйте триггер с ножной педалью и используйте микроманипулятор для управления иглой, в то время как элементы управления используются для перемещения предметного стекла. Убедитесь, что инъекционный болюс выбрасывается правильно, а затем выровняйте иглу по заднему полюсу первого эмбриона в ряду.

Перемещая ступень, введите иглу в эмбрион и введите болюс нуклеиновых кислот. Вводимая жидкость вызовет повышение внутреннего давления, что приведет к незначительному движению эмбриона. Отпустите педаль и немедленно, но аккуратно, извлеките иглу из эмбриона.

Небольшое количество цитоплазмы будет вытекать в месте инъекции. Это нормально. Если эмбрионы лопаются после инъекции, дайте эмбрионам высохнуть в течение нескольких минут, прежде чем покрыть их маслом.

После инъекции переложите предметное стекло в чашку Петри. Поместите диск из фильтровальной бумаги в крышку посуды. Пропитайте фильтр водой и закройте чашку Петри парафиновой пленкой.

Инкубируйте камеру при температуре 25 градусов по Цельсию. Через два дня после инъекции несколько раз в течение дня проверяйте предметные стекла на наличие вылупившихся личинок. Ищите личинок в масле и с помощью тонкой кисти переложите их в чашку Петри с кормом для личинок на основе моркови.

Загрузите в каждую тарелку до 200 личинок. Личинка не может долго выживать в масле, поэтому ищите часто. Инкубируйте личинок с почти закрытой крышкой, чтобы к личинкам еще поступал воздух.

Ежедневно проверяйте посуду и через неделю готовьтесь к сбору личинок, поместив посуду в емкость с отрубями. Соберите куколок и вскоре после этого ожидайте их появления. Позже обезболивают вылупившихся взрослых особей углекислым газом и осматривают их на предмет трансформации.

При отсеивании этот метод мобилизации может иметь решающее значение. Взрослых особей можно обезболить льдом или CO2, но длительное воздействие может снизить выживаемость других особей. Проверьте наличие красной флуоресценции с помощью красного широкого фильтра DS.

Или проверьте наличие зеленой флуоресценции с помощью фильтра EYFP. Пересадите трансформированных особей в небольшую клетку со взрослыми особями дикого типа противоположного пола для установления гетерозиготного штамма. В одном эксперименте для подавления экспрессии гена inx5 использовалась РНК с двойным напряжением.

Взрослая зародышевая линия неинъекционного контроля, по-видимому, нормальная, как и ожидалось, в то время как у обработанных особей наблюдалось недоразвитие яичек и яичников. Количественная оценка распространенности транскрипта inx5 в брюшной полке лиц обоих полов подтвердила значительно более низкую экспрессию гена по сравнению с контрольной группой. Во втором эксперименте два штамма с мечеными сперматозоидами были получены с использованием бета-2 тубулинового промотора для управления различными флуоресцентными маркерами.

Трансгенные самцы демонстрировали отчетливый флуоресцентный паттерн в организме и в яичках. В этом видео мы представляем наши оптимизированные протоколы для выращивания и микроинъекции нуклеиновых кислот в эмбрионы мухи. После освоения до 1000 эмбрионов могут быть введены в течение восьмичасового рабочего дня.

После этой процедуры можно использовать другие металлы, такие как thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine для разработки нового поколения штаммов medfly.