Создание и пересадку жировой производные стволовых клеток (ASC) листа в диабетической заживление модели

Общая цель этой процедуры заключается в проверке влияния листов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, в сочетании с искусственной кожей на заживление ран большого дефекта кожи на всю толщину у крыс с диабетом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о заживлении хронической раны, такой как большая диабетическая рана с обнаженной костью. Основное преимущество данной методики заключается в том, что клетки пересаживаются в рану твердыми листами по технологии клеточных листов, и в результате получается жизнеспособный, стабильный трансплантат.

В качестве донора жировой подушки планируйте использовать крыс Льюиса в возрасте от 8 до 33 недель. На месте операции подготовьте несколько стерильных аппликаторов с ватным наконечником, марлю, скальпель, иглодержатель, операционные ножницы, пару щипцов и нейлоновый шов 5-0. Для временного размещения тканей загрузите в чашку Петри объемом 100 миллилитров 10 миллилитров PBS.

Взвесьте загруженную PBS тарелку, чтобы позже найти массу собранной ткани. После обезболивания крысы расположите ее лежа на стерильной простыне. Затем побрейте операционную область и потрите открытые участки кожи, используя несколько чередующихся скрабов с содержанием этанола 70%.

Теперь сделайте трехсантиметровый разрез кожи в боковой нижней части живота. Далее обнажите и рассеките наружную косую мышцу. Затем обнажите жировую ткань придатка яичка, окружающую придаток яичка.

Далее аккуратно иссекаем придаток яичка и жировой ткани. Избегайте повреждения придатка яичка, яичек и кровеносных сосудов придатка яичка. Переложите салфетку в чашку PBS.

Затем закройте крысу-донора и следуйте стандартным методам послеоперационного ухода. Выделите АСК из двух-трех граммов собранной жировой ткани. Расщепляйте ткань в течение часа в 0,1% коллагеназе типа А, чтобы получить стромальную васкулярную фракцию, или SVF.

После очистки СВФ суспендировать СВФ в 20 миллилитрах среды. Разделите суспензию на две посуды по 60 квадратным сантиметрам и заквашивайте их в течение 24 часов в стандартных условиях. На следующий день трижды промойте пластины PBS, чтобы удалить все неприкрепленные клетки и мусор.

После окончательной стирки добавьте обратно свежий полный медиум. Затем продолжайте проходить клетки до тех пор, пока они не слится почти до полного слияния на третий день культивирования. Затем с помощью одного миллилитра 0,25%-ного трипсина ЭДТА проводят короткую инкубацию.

Удалите ячейки из тарелки. Не допускайте воздействия активного трипсина на клетки более 10 минут. После наблюдения и подсчета клеток подкультивируйте их с плотностью 1700 на квадратный сантиметр.

Затем проходите клетки каждые три дня и завершите три прохода, прежде чем продолжить. После того, как субкультивируемые крысы прошли ASC в третий раз, поместите 150 000 клеток в чашку диаметром 35 миллиметров, чувствительную к температуре, и добавьте два миллилитра питательной среды. Культивируйте посуду в течение трех дней в инкубаторе, чтобы получился равномерный клеточный лист.

Через три дня смените среду и добавьте 16,4 микрограмма на миллилитр АА. Затем культивируют клетки, меняя среду АК через день. Через четыре-пять дней приема среды, содержащей АА, проверьте пролиферацию АСЦ. Ищите промежутки между ячейками и прилегающим листом клетки.

После создания непрерывного листа ячеек их можно использовать для модели. При необходимости соберите лист ячейки, поместив пластину при комнатной температуре на 15-20 минут. Поскольку пластина чувствительна к температуре, клетки будут самопроизвольно отделяться в виде непрерывного листа, и лист может быть удален с помощью щипцов.

Для модели заживления ран при ожирении используйте взрослых самцов ZDF крыс в возрасте от 16 до 18 недель и весом от 500 до 600 граммов. Расположите крысу и обезболите ее на операционном поле, а перед бритьем головы очистите ее, используя 70% этанол. Затем побрейте операционную область и очистите открытые участки кожи чередующимися скрабами с 70% этанолом.

Примерно в это время перенесите чувствительную к температуре пластину с жировыми стволовыми клетками на стол. Прежде чем клеточный лист отсоединится от пластины, удалите среду и промойте клеточный лист PBS три раза. Собрав лист ячейки, замочите его в PBS до тех пор, пока он не понадобится.

Как только клетки будут готовы, сделайте дефект кожи размером 15 на 10 миллиметров на голове крысы. Сначала удалите кожную ткань вниз до надкостницы. Затем иссеките кожу и кожную ткань с помощью скальпеля и хирургических ножниц.

Для полного устранения дефекта удаляют надкостницу с помощью надкостницы. Затем поместите лист ячейки поверх дефекта. Лист стволовых клеток мягкий и гибкий.

Используйте щипцы, чтобы распространить его на каждый уголок дефекта. Теперь накройте лист клетки и дефект пластырем искусственной кожи размером 10 на 15 миллиметров, смоченной в физрастворе прямо перед использованием, и закройте рану примерно 10 швами с помощью нейлонового шва 5-0. Чтобы защитить рану, используйте нейлоновый шов 5-0, чтобы закрепить неадгезивную повязку размером 15 на 20 миллиметров на искусственной коже.

Планируйте соблюдать повязку через день, ведь крыса неизменно снимет ее, а при необходимости оперативно заменит повязку. В двух группах из шести жирных крыс с диабетом Цукера описанный протокол был использован для создания дефекта черепа. Экспериментальные крысы получали лист жировых стволовых клеток крысы, а контрольная группа — нет.

Через 14 дней раны в группе лечения были значительно меньше, чем в контрольной группе. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сделать большую рану с обнаженной костью у крыс, а затем обработать эту рану стволовыми клетками, полученными из жировой ткани. Пытаясь выполнить эту процедуру, обязательно используйте строгое регулирование температуры в течение всего процесса использования чувствительных к температуре посуды для культур.

В противном случае клетки могут самопроизвольно отделиться от тарелки, что задержит ваши эксперименты.