Использование Индуцированные анализа соматической сектора (ISSA) для изучения генов и промоутеров, участвующих в формировании древесины и вторичного развития Stem

Общая цель индуцированного анализа соматических секторов заключается в предоставлении метода средней или высокой пропускной способности для функциональной характеристики генных и промоторных конструкций в тканях вторичного стебля деревьев в относительно короткие сроки. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о том, где и когда экспрессируются гены, а также определить их роль в таких биологически важных процессах, как формирование древесины и развитие вторичного стебля. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой эффективную, простую и относительно быструю процедуру, применимую к широкому спектру видов деревьев.

Для начала подготовьте чистую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 миллилитров, налив в нее 19 миллилитров свежей среды LB, подогретой до 28 градусов Цельсия и содержащей соответствующие антибиотики для селекции бактерий. Добавьте один миллилитр культуры A.tumefaciens и измерьте оптическую плотность (OD) при 600 нанометрах. Если OD превышает 0,1, проведите дополнительное разведение теплой средой LB. Поместите культуру A.tumefaciens в шейкер-инкубатор до тех пор, пока OD 600 не достигнет значений от 0,4 до 0,6.

После достижения этого результата центрифугируйте клетки в течение 15 минут при температуре 4 °C и 1,000 x g. Слейте жидкость из пробирки и немедленно ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл охлажденной среды MS. Перенесите суспензию в чистую микропробирку объемом 2 мл и храните на льду до использования.

Начинайте эксперимент весной или в начале лета, выбирая растения с активным и быстрорастущим камбием. Это подтверждается тем, что флоэму можно легко отделить от ксилемы. Найдите прямой участок стебля у основания растения и удалите все листья или ветви.

С помощью острого скальпеля вырежьте камбиальное окно площадью один квадратный сантиметр, сделав два параллельных разреза флоэмы длиной 20 миллиметров на расстоянии пяти миллиметров друг от друга, а затем один горизонтальный разрез, пересекающий оба вертикальных разреза у основания. Откиньте полоску флоэмы вверх, чтобы обнажить развивающуюся ткань ксилемы. Затем с помощью пипетки добавьте достаточное количество инокуляционной среды, чтобы полностью смочить поверхность обнаженной ксилемы.

Сразу после этого вставьте полоску флоэмы обратно в стебель и плотно зафиксируйте ее парафильмом. Повторите эти этапы инокуляции для всех интересующих генов или промоторов, создавая новые камбиальные окна на расстоянии не менее одного сантиметра выше или ниже существующих окон со смещением на 90 градусов. Кроме того, инокулируйте окна векторами положительного и отрицательного контроля на том же стебле или стеблях, аналогично экспериментальным инокулятам.

Периодически контролируйте рост стебля и, как только будет зафиксирован радиальный рост не менее пяти миллиметров, соберите ткань для анализа на бета-глюкуронидазу (GUS-анализа). Чтобы собрать исследуемый материал, сначала вырежьте из стебля камбиальное окно, удалив все ткани, которые не относятся к новому приросту. Для исследований, касающихся морфологии зрелых клеток или тканей ксилемы и флоэмы, отделите флоэму от ксилемы.

В качестве альтернативы, для исследований, требующих сохранения целостности камбиальной зоны или оценки паттернов экспрессии промотора, поперечно разрежьте камбиальное окно лезвием бритвы, чтобы создать диски толщиной от 0.5 до 1 мм. Поместите полученные ткани камбиального окна в отдельные круглодонные пробирки объемом 14 мл и дважды промойте их в 0.1 М фосфатном буфере при pH 7 по пять минут за каждую процедуру, следя за тем, чтобы ткань была полностью погружена в раствор. По завершении второго промывания тщательно удалите излишки раствора.

Затем добавьте по пять миллилитров реагента GUS в каждую пробирку. Если этого недостаточно для полного покрытия образца ткани, добавьте дополнительный объем реагента. Инкубируйте пробирки в течение десяти минут при 55 °C в темноте.

После этого инкубируйте пробирки еще в течение 12–16 часов на шейкере при 37 °C в темноте при осторожном перемешивании. После извлечения из инкубатора возьмите случайную выборку пробирок и проверьте pH реагента GUS с помощью лакмусовой бумаги с диапазоном pH от нуля до семи. Если в какой-либо из них pH ниже шести, промаркируйте их и проверьте остальные пробирки.

Промаркируйте и исключите все пробирки, в которых pH ниже шести. Слейте GUS-реагент из пробирок и замените его достаточным количеством 70%-го этанола, чтобы полностью покрыть ткань. Храните образцы при температуре четыре °C до востребования.

С помощью чистого пинцета извлеките всю ткань камбиального окна из пробирки с образцом и поместите ее на небольшой лоток или в чашку Петри для микроскопического исследования. Поместите образец под объектив стереомикроскопа при увеличении от 1X до 4X, затем определите и подсчитайте количество клеток или тканей с ярко-синим окрашиванием. В тех случаях, когда флоэма была удалена, подсчитайте количество секторов в камбиальной ткани, обнаруженных на поверхности развивающейся ксилемы.

Для образцов, разрезанных на диски, подсчитайте количество секторов, обнаруженных в различных типах клеток или тканей. Убедитесь, что осмотрены обе стороны диска, а секторы, расположенные на двух соседних дисках, сопоставлены, чтобы избежать завышения показателей. Поместите только те фрагменты ткани, содержащие секторы, обратно в пробирку с 70% этанолом и храните до востребования.

Повторите анализ для всех остальных собранных камбиальных окон, включая положительный и отрицательный контроли. Для точной идентификации и классификации секторов мы рекомендуем ознакомиться с анатомией и развитием вторичных тканей стебля, включая реакции стебля на повреждения. На данном рисунке показано несколько успешных трансформаций, которые здесь выглядят как области синего окрашивания.

На примере окна с отслаиванием флоэмы видны многочисленные трансформированные сектора; диски, полученные от двух видов деревьев, демонстрируют сектора трансформации и последующий радиальный рост. Также может наблюдаться трансформация в различных типах тканей. Здесь видны сектора стебля в перидерме, флоэме, паренхиме раны и нескольких других тканевых областях белого тополя.

На этом изображении представлены результаты экспрессии промоторов генов в производных камбия. В данном примере показана доля окрашивания в каждом типе ткани в эксперименте с использованием ряда промоторов CesA из eucalyptus grandis, трансформированных в стебли гибридов эвкалипта. Экспрессия в флоэме, развивающейся и развитой ксилеме представлена в процентах.

Среднее количество событий трансформации на сантиметр инокулированного камбия также может быть рассчитано для каждого промотора или интересующего гена. В этой таблице представлены данные для типичных секторов, выявленных в образцах эвкалипта и тополя, трансформированных положительным контролем или интересующим промотором, которые были проанализированы методом сбора дисков. После освоения эта методика может стать быстрым, эффективным и широко применимым способом изучения сложной природы дифференцировки камбия при формировании вторичного развития стебля.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать растения и бактерии, проводить трансформацию, выращивать и собирать стебли, а также определять и классифицировать трансгенные ткани для фенотипической оценки.