Методы изоляции, культуры и функциональная характеристика САУ миоцитов от взрослых мышей

Общая цель этой процедуры заключается в выделении спонтанно активных миоцитов синоатриальных узлов у мышей для краткосрочных или среднесрочных электрофизиологических или визуализирующих экспериментов. Изолированные миоциты синоатриального узла важны для изучения механизмов создания ритма сердца, в частности для изучения специфических ионных токов или времени внутриклеточного высвобождения кальция. Но относительно немногие лаборатории используют изолированные миоциты синоатрия от мышей, отчасти потому, что очень трудно изучить эту процедуру, основываясь только на письменных методах.

Приготовив все требуемые растворы для изоляции, удалите шерсть с груди животного ножницами. Затем пересеките грудную клетку, чтобы обнажить грудную полость, с помощью наружных тканевых щипцов и ножниц для рассечения. Промойте грудную полость двумя миллилитрами подогретого комплектного Tyrode's с гепарином.

Под препарирующим микроскопом аккуратно извлеките легкие и вилочковую железу с помощью внутренних ножниц и щипцов для рассечения. Осторожно удерживая верхушку сердца, осторожно разрежьте нижнюю полую вену и аорту, чтобы удалить сердце из грудной полости. Затем перенесите сердце в одну из силиконовых посуд, а затем промойте его двумя-четырьмя миллилитрами подогретого гепаринизированного полного Tyrode's.

Сориентируйте сердце так, чтобы задние сосуды были видны и обращены вверх. Затем обездвижите сердце, вдавив его через верхушку в силиконовую чашку для вскрытия. После этого найдите борозду между желудочками и предсердиями.

С помощью ножниц для внутреннего рассечения сделайте надрез в бороздке, держа его близко к желудочкам. Промойте бороздку и разрез дополнительным подогретым гепаринизированным полным Tyrode's по мере необходимости, чтобы обеспечить четкий обзор предсердий и клапанов. Затем продолжайте резать вдоль бороздки, чтобы отделить предсердия от желудочков.

Впоследствии перенесите ткань предсердий во вторую силиконовую диссекционную чашку и промойте ее тремя миллилитрами подогретого гепаринизированного полного Tyrode's. После этого, осторожно растягивая препарат, проденьте ткань через нижнюю полую вену. Затем переверните ткань так, чтобы правое предсердие животного теперь находилось с левой стороны экспериментатора, а левое предсердие — с правой стороны экспериментатора.

Очень важно получить и распознать ориентацию, чтобы изолировать правильную ткань. Приступайте к прокалыванию ткани через верхнюю полую вену, затем правый и левый придатки предсердия. Удалите оставшийся жир или другую ткань, чтобы обеспечить четкий обзор препарата.

Впоследствии вскройте переднюю стенку предсердий, разрезав полые вены. Поворачивайте чашку по мере необходимости, чтобы рассекать как верхнюю, так и нижнюю полые полые полости. При необходимости переместите штифты, чтобы визуализировать межпредсердную перегородку.

Затем разрежьте вдоль межпредсердной перегородки, чтобы удалить левое предсердие. Снова приколите препарат, аккуратно растяните его, и удалите жир из-за синоатриального узла. После этого удалите правый придаток предсердия, затем освободите синоатриальный узел, разрезав вдоль crista terminalis, который выглядит как темно-оранжевая полоса, окаймляющая придаток предсердия.

Снова приколите или открепите узловую ткань и разрежьте ее сбоку, чтобы получить три полоски одинакового размера. В ходе этой процедуры с помощью узкой пипетки, отполированной огнем, перенесите три полоски ткани синоатриального узла в первую из трех небольших пробирок с круглым дном, содержащих 2,5 миллилитра Tyrode's с низким содержанием кальция и магния, и инкубируйте в течение пяти минут. Через пять минут перенесите полоски ткани во вторую маленькую круглую донную трубку, содержащую 2,5 миллилитра магния Tyrode's с низким содержанием кальция и магния.

Промойте полоски салфетки, осторожно вращая трубку или аккуратно пипетируя узкой пипеткой. Не переворачивайте трубку. Затем переложите полоски ткани в третью маленькую трубку с круглым дном, содержащую 2,5 миллилитра Tyrode's с низким содержанием кальция и магния, и повторите этап промывки.

После этого переложите полоски в большую пробирку с круглым дном, содержащую 2,5 миллилитра тирода с низким содержанием кальция и магния с ферментами. Перемешивайте каждые пять минут, осторожно поворачивая трубку. После расщепления ферментов с помощью узкой отполированной огнем пипетки аккуратно перенесите полоски ткани в первую из трех небольших пробирок с круглым дном, содержащих модифицированный раствор KB.

Затем пропустите полоски через вторую и третью маленькие трубки с круглым дном, чтобы промыть ткань, прежде чем переложить их в большую трубку с круглым дном, содержащую раствор KB. Используя большую дозатор с огненной полировкой, диссоциируйте ячейки в большой трубке с круглым дном путем постоянного растирания, стараясь держать диссоциационную трубку погруженной в водяную баню с температурой 35 градусов Цельсия и избегать попадания пузырьков в раствор. Мы обнаружили, что лучше всего работает принудительное выталкивание раствора с частотой примерно один раз в секунду или один герц.

Теперь добавьте в ткани 75 микролитров раствора адаптации хлорида натрия и кальция. Аккуратно перемешайте и выдержите их в течение пяти минут. Продолжайте добавлять кальций постепенно, как указано в письменном протоколе.

После реадаптации кальция соберите миоциты синоатрии, дав им отстояться в течение примерно 10 минут или центрифугируя при 2000 г в течение трех минут. Для остро изолированных клеток аккуратно удалите и выбросьте около пяти миллилитров надосадочной жидкости с помощью переводной пипетки. Затем храните клетки при комнатной температуре до восьми часов для экспериментов с пластырем.

Впоследствии можно провести функциональную оценку изолированных миоцитов синоатрии с помощью записей патч-клэмпа для потенциалов спонтанного действия и мембранных токов. Спонтанно активные миоциты синоатрия могут сохраняться в культуре до шести дней. Культивируемые клетки сохраняют общую морфологию, которая очень похожа на морфологию остро изолированных синоатриальных миоцитов, без существенных изменений в средней длине, ширине, площади поперечного сечения или емкости мембраны культивируемых клеток по сравнению с остро выделенными клетками.

Ячейки подходят для ряда экспериментальных исследований, таких как регистрация тока и напряжения на клещах. Здесь в качестве примеров показаны потенциалы спонтанного действия и забавный поток. После освоения диссекция синоатриального узла, изоляция и повторное введение кальция могут быть завершены примерно за два часа, чтобы у вас были клетки, готовые к проведению экспериментов.

При проведении этой процедуры важно помнить, что ориентация ткани имеет решающее значение для хорошего рассечения и что этапы ферментативной и механической диссоциации должны быть оптимизированы, как описано в тексте. После этой процедуры выделенные миоциты синоатриального узла могут быть использованы для различных экспериментов, включая электрофизиологию одиночных клеток, визуализацию кальция и иммуноцитохимию. Клетки также могут быть сохранены в культуре для экспериментов, требующих манипуляций с генами или экспрессии репортерных молекул.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить синоатриальные миоциты от взрослых мышей. Удачи в ваших экспериментах.