Adenofection: метод изучения роли молекулярных шаперонов в клеточных морфодинамики истощением-спасательных экспериментов

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы обеспечить проведение экспериментов по спасению истощения в условиях, сохраняющих клеточную целостность и белковый гомеостаз. Для функционального анализа биологических процессов на уровне отдельных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся функций белка и требований к структуре в клеточной динамике, таких как митоз и дифференцировка клеток.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он истощает интересующий нас белок и в то же время повторно вводит вариант этого белка на неофизиологическом уровне в измеренную популяцию клеток. Начните с покрытия стеклянной посуды фрибронектином. Для этого нужно развести один миллиграмм на миллилитр фирбронектинового запаса один к 100 стерильным PBS.

Добавьте по одному миллилитру в каждую 35-миллилитровую посуду, чтобы покрыть всю поверхность. Выдерживать в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе. Во время инкубации предварительно подогревают альфа-МЕМ с добавлением 10% FBS и аликвоту 0,05% трипсина ЭДТА до 37 градусов Цельсия.

После 45 минут инкубации приступайте к приготовлению клеточного раствора. Аспирируйте среду из 10-сантиметровой пластины клеток HeLa RFP H2B. И дважды аккуратно смыть 1,5 миллилитрами 0,05%-ного трипсина ЭДТА.

Оставьте 0,5 миллилитра трипсина ЭДТА на тарелке после последней аспирации. И инкубируйте клетки в течение двух-трех минут при температуре 37 градусов по Цельсию. И 5% углекислого газа.

Аккуратно постучите по тарелке. И понаблюдайте за клеточным слоем под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки были отделены. Затем добавьте 10 миллилитров среды и осторожно несколько раз аккуратно разделите клетки и переведите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.

Подсчитайте образец клеточной суспензии объемом 10 микролитров с помощью гемоцитометра. Далее отсадите раствор фибронектина из стеклянной посуды. Не допускайте высыхания фибронектина перед нанесением клеточного покрытия.

Приготовьте клеточный раствор суспензии в 1,5 раза по десять-пятую клеток на 35 миллиметровую посуду в двух миллилитрах среды. Пластина одна 35-миллиметровая пластина в дополнение к числу условий для того, чтобы подсчитать количество клеток до передачи вируса. Инкубируйте от 30 до 45 минут.

По истечении времени инкубации проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки хорошо разделены. Как видно здесь. Верните тарелки в инкубатор и выращивайте клетки до следующего дня.

На следующий день после нанесения покрытия убедитесь, что плотность клеток достигла не менее 50% А плотность клеток ниже 50% приводит к снижению эффективности передачи вируса. Повышенная вариабельность экспрессии белка на клетку и повышенная токсичность для клеток. Затем соберите клетки из дополнительной тарелки, как и раньше.

И посчитайте количество ячеек. Рассчитайте объем вирусов, необходимый для эффективной трансдукции клеток. Наклейте этикетку на микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра для каждого состояния.

И добавляем 400 микролитров теплого альфа MEM минус. После медленного размораживания аликвот вирусов на льду добавьте в пробирки необходимый объем каждого вируса и аккуратно перемешайте пипетированием. Далее, после отсасывания среды из клеток, аккуратно добавьте вирусную смесь по каплям.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Каждые 15 минут в течение одного часа осторожно взбалтывайте пластины под стерильным колпаком, чтобы покрыть клетки вирусом. Использование небольшого количества среды облегчает контакт вируса с клетками.

После инкубации аккуратно пипеткой пипеткой по 1,6 миллилитра альфа МЕМ минус на каждую пластину до получения общего объема в два миллилитра. Затем начните синхронизацию клеток, добавив два миллимоляра тимидина, прежде чем инкубировать клетки в течение еще двух часов. Тем временем приготовьте смесь для трансфекции миРНК, добавив в микропробирку 139 микролитров стерильной воды, 50 микролитров одного молярного хлорида кальция и 11 микролитров 20 микромолярных миРНК.

Если миРНК не требуется, замените количество миРНК стерильной водой, чтобы выполнить пустую трансфекцию. Медленно добавляйте раствор HBSS2X в смесь миРНК хлорида кальция. Аккуратно перемешайте два раза путем впрыска воздуха с помощью пипетки объемом 200 микролитров.

Поскольку меньшее количество осадков приводит к лучшей эффективности трансфекции. Затем выдержите смесь в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации медленно добавьте по 200 микролитров по каплям в каждую тарелку и перемешайте, чтобы перемешать.

Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение 16 часов. На следующий день выньте посуду из инкубатора и перевезите ее в колпак для культуры тканей. Промыв клетки дважды двумя миллилитрами теплого гиписи, добавьте два миллилитра альфа MEM минус перед возвращением в инкубатор.

Через семь часов добавьте в планшеты два миллимоляра тимидина, прежде чем вернуть их в инкубатор. Работайте не более чем с четырьмя клеющими пластинами одновременно, так как колебания температуры влияют на продолжительность клеточного цикла. На следующий день, через 48 часов после трансфекции миРНК и инфицирования вирусом, дважды промойте клетки двумя миллилитрами теплого PBS, а затем добавьте два миллилитра альфа-MEM без фенолового красного для визуализации живых клеток.

Выдерживать в течение семи часов. Проводите краткосрочные эксперименты по визуализации живых клеток на митотических клетках с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного увлажненной терморегулируемой камерой с содержанием 5% углекислого газа. Перед приобретением убедитесь, что камера достигла соответствующей температуры 37 градусов по Цельсию.

Поместите культивированные чашки в камеру микроскопа за час до получения данных, чтобы обеспечить надлежащее равновесие среды и избежать смещения фокуса из-за изменений температуры. Исследуйте митотический статус клеток. На данный момент.

От 10 до 15% клеток должны находиться на ранних стадиях митоза. Во время уравновешивания настройте параметры сбора данных, определенные в предыдущих экспериментах. Важно добиться соответствующего разрешения без обесцвечивания фотографий.

Так как это вызывает повреждение клеток и нарушает митотическую прогрессию. Выберите несколько полей, содержащих ячейки, которые находятся на митотическом входе в каждое условие, чтобы получить значительное количество ячеек для анализа, не превышая интервал сбора. После того, как все поля будут выбраны, сбросьте фокус и начните сбор данных как можно быстрее.

С помощью вращающегося диска можно сфокусировать систему. Типичная настройка включает в себя четыре различных условия. Семь полей на пластину.

И двухцветный канал с интервалом от 1,5 до двух минут на 75 минутном периоде. Определите четко определенные критерии для анализа митотических фенотипов в клетках, которые будут зависеть от используемых флуоресцентных маркеров. В отличие от трансфекции BAG3 GFP, плазменной ДНК, как видно слева, аденофекция рекомендательными аденовирусами, показанная здесь справа, обеспечивает более однородную и эффективную экспрессию BAG3 GFP.

У большинства клеточной популяции при низкой кратности инфекции. Этот репрезентативный вестерн-блот показывает, что аденофекция со специфичными для BAG3 миРНК и рекомпотентным аденовирусом BAG3 GFP позволяет эффективно истощать эндогенный BAG3 и реинтродуцировать белок BAG3 GFP на уровне, близком к эндогенному. Как показано здесь, аденофекция может сохранить белковый гомеостаз, поскольку не наблюдается заметного увеличения уровней белков теплового шока, вызванных стрессом, в клетках HeLa, которые были аденофицированы.

В отличие от клеток HeLa, обработанных протеотоксичным индуктором стресса MG132. Здесь мы видим, что прогрессия клеток через митоз существенно не нарушается аденофекцией, как показано на этих конфокальных изображениях замедленной съемки клеток HeLa, аденофицированных контрольной миРНК и BacMam GFP альфа тубулином. и BacMam FRP Actin.

На графике указана доля клеток с аномальным митозом. Клетки, аденофектированные только специфичной для BAG3 миРНК, продемонстрировали примерно двукратное увеличение уровня митотических дефектов. Как показано красной полосой.

Который был восстановлен до уровня, близкого к уровню контрольной клетки, путем повторного введения BAG3 GFP, показанного черной полосой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперименты по восстановлению истощения с помощью аденофектии. Этот метод обеспечивает быструю и простую систему для создания гипоморфных нокдаунов для анализа структурных функций в нескольких клеточных фонах.

Следуя этому методу, можно определить ключевые структурные требования к белку, представляющему интерес для данной функции. Другие подходы к редактированию генома могут быть использованы для углубления механики.