Экстракорпоральное записи мезентериального афферентными нервными активность у мышей тощей и ободочной кишки Сегменты

Общая цель данного метода заключается в регистрации in vitro активности спленических афферентных нервов из одного пучка нервов тощей или ободочной кишки в ответ на постепенное растяжение и воздействие различных соединений. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, происходит ли гиперсенсибилизация или десенсибилизация афферентных нервов, иннервирующих желудочно-кишечный тракт, при различных патологических состояниях. Основными преимуществами данной методики являются возможность регистрации разрядов нервов in vitro и возможность количественной оценки нервной активности без модуляции или влияния со стороны центральной нервной системы.

Применение данной методики распространяется на терапию или диагностику ряда болевых синдромов, таких как синдром раздраженного кишечника, поскольку сенсибилизация нервов играет важную роль в их патогенезе. Как правило, лицам, впервые осваивающим данный метод, будет трудно, так как препарирование нервных пучков и анализ отдельного модуля зарегистрированного сигнала потребуют значительного обучения. Для начала процедуры поместите эвтаназированную мышь в положение на спине.

Выполните срединный разрез передней брюшной стенки через кожу и слой мышц живота скальпелем от мечевидного отростка до лобковой кости. После этого промойте брюшную полость холодным раствором Кребса, чтобы предотвратить высыхание внутрибрюшных тканей. Затем быстро иссеките весь jejunum с помощью острых ножниц, удалив примерно 20 сантиметров тонкого кишечника, начиная непосредственно от дуодено-еюнального изгиба.

Будьте осторожны, чтобы не повредить окружающие структуры, и сохраняйте целостность брыжейки кишечника, в которой проходят кровеносные сосуды и афферентные нервы тощей кишки. Затем поместите иссеченную тощую кишку в холодный раствор Кребса на льду, обеспечивая постоянную оксигенацию с помощью Carbigen. После этого разрежьте тощую кишку на петли длиной примерно три сантиметра.

Найдите брыжеечный пучок, содержащий сосуды и спланхнический нерв, примерно в центре соответствующей петли, чтобы облегчить ее закрепление в регистрирующей камере. Затем промойте каждый сегмент раствором Крэбса с помощью тупого катетера, чтобы удалить содержимое просвета и химус, так как они содержат пищеварительные ферменты, которые ускорят разрушение образца ткани in vitro. После этого выберите сегмент для измерения активности афферентного нерва и поместите его в регистрирующую камеру, покрытую слоем силиконового эластомера.

Поддерживайте температуру раствора Кребса в регистрационной камере на уровне 34 °C. Затем закрепите сегмент тощей кишки в органной ванне так, чтобы оральный конец был соединен с приводом шприца, обеспечивающим просветный ток, а аборальный конец — с оттоком. Слегка растяните сегмент, стараясь не создавать избыточного натяжения.

Плотно закрепите оба конца с помощью шелковых лигатур к входному и выходному портам. После этого подсоедините шприцевой насос к оральному концу и проведите внутрипросветную перфузию сегмента jejunum раствором Кребса со скоростью 10 milliliters в час. Прикрепите брыжейку установленного сегмента кишечника кнопками-булавками к нижнему слою из силиконового эластомера в расправленном состоянии.

Затем растяните брыжейку, чтобы оптимизировать визуализацию брыжеечного пучка. Далее проведите тест на постепенное растяжение, перекрыв выходной порт до тех пор, пока внутрипросветное давление сегмента кишечника не достигнет 60 мм рт ст, чтобы убедиться в отсутствии утечки раствора Кребса из закрепленного сегмента. Наблюдайте за плавным повышением внутрипросветного давления без перерывов.

На начальном этапе растяжения ожидаются небольшие сокращения сегмента. При необходимости заблокируйте перистальтическую активность, добавив в раствор Кребса 1 мкмоль нифедипина — блокатора кальциевых каналов L-типа. Под стереомикроскопом осторожно начните отделять жировую ткань от брыжейки, аккуратно потягивая ее двумя маленькими пинцетами; будьте внимательны, чтобы не повредить сосуды и афферентный нерв, находящиеся в жировой ткани.

Начните отделять жировую ткань на некотором расстоянии от тощей кишки, чтобы обнажить оба кровеносных сосуда в брыжеечном пучке. Найдите приносящий нерв тощей кишки между обоими сосудами в виде тонкой белой нити, заключенной в жировую ткань. Затем проведите диссекцию более проксимально по направлению к тощей кишке, осторожно отделяя жировую ткань с помощью пинцета.

Затем препарируйте брыжеечный нерв тощей кишки данного сегмента, удаляя прилегающую к нерву жировую ткань. Перережьте нерв острыми ножницами для тканей. При необходимости аккуратно отделите остатки жира, соединительной ткани, а также эпиневральную оболочку, осторожно потянув за них.

В данной процедуре с помощью микроманипулятора опустите кончик аспирационного электрода в органный бачок. Затем осторожно аспирируйте небольшое количество раствора Кребса из бачка так, чтобы кончик электрода был погружен в раствор Кребса. Убедитесь, что раствор Кребса покрывает проволочный электрод внутри аспирационного электрода.

Затем расположите кончик всасывающего электрода непосредственно рядом с пересеченным пучком афферентных нервов и втяните пересеченный нервный пучок в капилляр по всей его длине. Переместите кончик электрода в сторону жировой ткани и с помощью поршня аспирируйте ее в стеклянный капилляр, тем самым механически изолировав нерв в капилляре от содержимого органной ванны. Надлежащая герметизация стеклянного капилляра относительно регистрирующей камеры путем аспирации части окружающей жировой ткани в капилляр имеет решающее значение для минимизации избыточного фонового шума, который в конечном итоге может затруднить финальный анализ.

Для проверки регистрации активности афферентных нервов вызовите увеличение частоты импульсации афферентных волокон путем постепенного растяжения, перекрыв выходной порт для плавного повышения давления в сегменте кишечника. Приступайте к выполнению основного экспериментального протокола только в том случае, если три последовательных растяжения привели к воспроизводимому многоединичному разряду. После изоляции нерва стабилизируйте препарат в течение 15 минут для достижения устойчивой спонтанной активности афферентного нерва перед началом фактических экспериментов.

Здесь представлена схематическая репрезентация различных единиц афферентных волокон на основе их механосенситивного профиля. Волокна с низким порогом преимущественно демонстрируют повышенную активность нерва при низком давлении растяжения, что приводит к проценту LT более 55%. Единицы с высоким порогом, напротив, проявляют увеличение частоты импульсации только при болевом давлении. Волокна с широким динамическим диапазоном демонстрируют постепенное увеличение активности нерва на протяжении всего растяжения, в то время как механически нечувствительные волокна не реагируют на возрастающее давление растяжения.

На данном рисунке показана разрядка афферентных нервов брыжейки у мышей дикого типа при постепенном растяжении. Обратите внимание, что при двухфазном профиле растяжения начальный рост разрядки нерва обусловлен волокнами с низким порогом и широким динамическим диапазоном, тогда как волокна с высоким порогом и широким динамическим диапазоном способствуют второму увеличению разрядки. При должном навыке изоляция нерва тощей кишки и первичная запись базовой линии могут быть выполнены менее чем за один час при правильном проведении процедуры.

При изучении действия соединений, вводимых в органный бань, требуется больше времени. При выполнении этой процедуры важно придерживаться строго стандартизированного подхода, например, последовательно идентифицировать один и тот же сегмент для всех экспериментов. После этой процедуры можно применить другие методы, такие как выделение ганглиев задних корешков с последующей визуализацией кальция, чтобы определить, какие релейные станции желудочно-кишечной нервной системы задействованы в патогенезе ряда заболеваний.

После своей разработки эта методика открыла исследователям в области нейронаук путь к изучению патогенеза нескольких болевых синдромов в гастроэнтерологических исследованиях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать афферентные нервы тощей кишки из желудочно-кишечного тракта мыши и регистрировать их активность во время постепенного растяжения.