Определение дзета-потенциала через наночастицу транслокации через скоростей перестраиваемого нанопор: Использование ДНК-модифицированных частиц, как в примере

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы охарактеризовать химический состав поверхности наночастиц с помощью настраиваемого резистентного постзондирования (TRPS) и определить дзета-потенциал материала. Это демонстрируется путем определения характеристик модифицированных ДНК наночастиц. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области характеристики наноматериалов и разработки биоанализа.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что вы можете проводить анализ по частицам. Каждый сигнал частицы ДНК преобразуется в измерение дзета-потенциала, что дает полную картину анализируемого образца. Самый старый метод мог бы дать представление о характеристиках материалов.

Он также может быть применен для других целей, таких как разработка биотестов для обнаружения клеток, вирусов, ДНК и белков. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что это не просто ввести сампу, а затем ждать ответа. Необходим некоторый вклад со стороны ученого.

Чтобы начать эту процедуру, вихревой стрептавидин покрывал частицы в течение 30 секунд перед ультразвуковой обработкой в течение двух минут при мощности 80 Вт, чтобы обеспечить монодисперсность. Разбавьте покрытые стрептавидином частицы один к ста в буфере PBST до достижения результирующей концентрации от одного умноженного на десять до девяти частиц на миллилитр. Затем переведите частицы на вихрь в течение 30 секунд.

Исходя из связывающей способности 4, 352 пикомола на миллиграмм при соответствующей концентрации ДНК к частицам для результирующих концентраций 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 и 210 наномоляров. После вортексирования образцов в течение 10 секунд поместите их на вращающееся колесо при комнатной температуре на 30 минут, чтобы позволить ДНК соединиться с поверхностью частиц посредством взаимодействия стрептавидина с биотином. После того, как захваченная ДНК была добавлена и инкубирована с частицами, удалите излишки ДНК и раствора с помощью магнитной сепарации, поместив образцы на магнитный штатив на 30 минут.

После этого удалите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить вновь образовавшийся кластер частиц, ближайший к магниту. Затем замените надосадочную жидкость таким же объемом свежего PBST-буфера. Теперь добавьте необходимое количество целевой ДНК в каждый образец, чтобы обеспечить достижение максимально возможного связывания с мишенью.

Переведите образцы на вихрь в течение 10 секунд. И поместите их на вращающееся колесо при комнатной температуре на 30 минут. После завершения гибридизации удалите избыток целевой ДНК с помощью магнитной сепарации, поместив образцы на магнитный штатив на 30 минут.

Далее удалите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить вновь образовавшийся кластер частиц, ближайший к магниту. Затем замените надосадочную жидкость таким же объемом свежего PBST-буфера. После повторения предыдущих шагов для дубликатов образцов поместите образцы на вращающееся колесо при комнатной температуре на 16 часов, чтобы исследовать время гибридизации ДНК.

На этом этапе подключите прибор TRPS к компьютерной системе с установленным программным обеспечением. С помощью штангенциркуля измерьте расстояние между внешней стороной двух параллельных губок. Введите расстояние в поле растяжки на вкладке настроек прибора и нажмите на кнопку калибровать растяжку под вкладкой.

После этого латерально надевают полиуретановую нанопористую мембрану соответствующего размера для анализа на челюсти с идентификационным номером нанопор вверх. Затем растяните губки до необходимого для анализа растяжения с помощью ручки регулировки растяжения на боковой стороне инструмента. Поместите 80 микролитров PBST-буфера в нижнюю жидкостную ячейку под нанопорой, убедившись, что в ней нет пузырьков, которые могут повлиять на измерение.

Теперь установите верхнюю ячейку жидкости на место и добавьте 40 микролитров буфера, убедившись, что в ней нет пузырьков. Затем поместите клетку Фарадея над системой и приложите внешнее давление, как описано в текстовом протоколе. После помещения 40 микролитров калибровочных частиц в верхнюю жидкостную ячейку завершите измерение TRPS при трех приложенных напряжениях.

Измените напряжение, нажав на кнопки с плюсом и минусом на шкале напряжения во вкладке настроек прибора в программном обеспечении. Убедитесь, что три напряжения возвращают соответствующие фоновые токи. И убедитесь, что при среднем напряжении калибровочные частицы производят среднюю величину блокады не менее 0,3 наноампера.

После того, как условия, изложенные в текстовом протоколе, будут выполнены, запустите прогон, нажав кнопку «Пуск» в программном обеспечении на вкладке сбора данных. Чтобы завершить измерение, нажмите «Стоп» на вкладке сбора данных и сохраните файл данных. Промойте систему, заменив калибровочные частицы на 40 микролитров с PBST-буфером в верхние клетки жидкости несколько раз.

И применяя различные давления до тех пор, пока не исчезнут события блокады, гарантируя, что нет остаточных частиц и перекрестного загрязнения. После достижения соответствующего базового тока замените электролит в верхней жидкостной ячейке на 40 микролитров образца. Запустите пример прогона, нажав кнопку Пуск на вкладке Получение данных.

Запишите не менее 500 частиц и убедитесь, что время работы составляет не менее 30 секунд. Чтобы завершить измерение, нажмите «Стоп» на вкладке сбора данных и сохраните файл данных. Приведен пример анализа размера и дзета-потенциала частиц, покрытых стрептавидином без модификаций, и покрытых стрептавидином частиц, насыщенных одноцепочечной ДНК на поверхности.

Хотя оба образца были одинакового размера, дзета-потенциал значительно отличался и был намного больше, когда ДНК функционализировалась на поверхности частицы. Здесь представлены данные о размере и дзета-потенциале образцов с самой низкой и самой высокой концентрацией ДНК, гибридизованной с частицами, покрытыми стрептавидином. Большее значение дзета-потенциала зарегистрировано для частиц, гибридизованных с более высокой концентрацией ДНК.

Здесь показано изменение дзета-потенциала, измеренное только для зондированной ДНК захвата, полностью комплементарной мишени ДНК, мишени ДНК со средним связыванием, мишени ДНК с конечным связыванием и нависающей мишени ДНК. После освоения этой техники ее можно выполнить за 20 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о тщательной промывке нанополя между каждой калибровкой и образцом, чтобы убедиться в отсутствии перекрестного загрязнения между образцами и предотвратить блокировку нанополей.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биочувств к изучению взаимодействий белок-белок и белок-ДНК в мультиплексных анализах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить дзета-потенциал с помощью TRPS и подготовить модифицированные ДНК частицы для биотестов.