Определение дзета-потенциала через наночастицу транслокации через скоростей перестраиваемого нанопор: Использование ДНК-модифицированных частиц, как в примере

Общая цель данной процедуры заключается в определении химических свойств поверхности наночастиц с помощью метода анализа на основе перестраиваемого резистивного датчика (TRPS) и определении дзета-потенциала материала. Это демонстрируется на примере анализа наночастиц, модифицированных ДНК. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы при характеризации наноматериалов и разработке биоаналитических систем.

Основным преимуществом данного метода является возможность проведения анализа каждой отдельной частицы. Сигнал от каждой частицы ДНК преобразуется в измерение дзета-потенциала, что дает полную картину анализируемого образца. Этот классический метод позволяет получить данные для характеристики материалов.

Этот метод также может быть применен в других областях, таких как разработка биоанализов для обнаружения клеток, вирусов, ДНК и белков. Как правило, новичкам в данной методике бывает сложно, так как она не сводится к простому введению образца и ожиданию результата; требуется определенное участие исследователя.

Для начала данной процедуры перемешайте частицы, покрытые стрептавидином, на вортексе в течение 30 секунд, затем подвергните их воздействию ультразвука в течение двух минут при мощности 80 Вт для обеспечения монодисперсности. Разведите частицы, покрытые стрептавидином, в буфере PBST в соотношении 1:100, чтобы получить конечную концентрацию 1×10⁹ частиц/мл. После этого снова перемешайте частицы на вортексе в течение 30 секунд.

Исходя из связывающей способности 4, 352 пмоль на мг при соответствующей концентрации ДНК по отношению к частицам, были получены конечные концентрации 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 и 210 нМ. После перемешивания образцов на вортексе в течение 10 секунд их помещают на ротатор при комнатной температуре на 30 минут, чтобы ДНК связалась с поверхностью частиц посредством стрептавидин-биотинового взаимодействия. После добавления захваченной ДНК и инкубации с частицами удаляют избыток ДНК и раствора методом магнитной сепарации, поместив образцы на магнитный штатив на 30 минут.

После этого удалите супернатант, стараясь не потревожить вновь образовавшийся кластер частиц, находящийся ближе всего к магниту. Затем замените супернатант таким же объемом свежего буфера PBST. Теперь добавьте в каждый образец необходимое количество целевой ДНК, чтобы обеспечить максимально возможное связывание мишени.

Перемешайте образцы на вортексе в течение 10 секунд. Затем поместите их на ротор при комнатной температуре на 30 минут. После завершения гибридизации удалите избыток целевой ДНК с помощью магнитной сепарации, поместив образцы на магнитный штатив на 30 минут.

Затем удалите супернатант, стараясь не потревожить вновь образовавшийся кластер частиц, расположенный ближе всего к магниту. После этого замените супернатант тем же объемом свежего буфера PBST. Повторив предыдущие шаги для дублирующих образцов, поместите их на ротационное колесо при комнатной температуре на 16 часов для изучения времени гибридизации ДНК.

На этом этапе подключите прибор TRPS к компьютерной системе с установленным программным обеспечением. С помощью штангенциркуля измерьте расстояние между внешними краями двух параллельных зажимов. Введите полученное значение в поле растяжения (stretch) на вкладке настроек прибора и нажмите кнопку «calibrate stretch» под этой вкладкой.

После этого установите боковыми сторонами полиуретановую нанопористую мембрану подходящего размера для анализа в зажимы так, чтобы идентификационный номер нанопоры был обращен вверх. Затем с помощью рукоятки регулировки растяжения, расположенной сбоку прибора, растяните зажимы до значения, необходимого для анализа. Поместите 80 µL буфера PBST в нижнюю жидкостную ячейку под нанопорой, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха, которые могут повлиять на результаты измерений.

Теперь зафиксируйте верхнюю жидкостную ячейку щелчком и добавьте 40 µL буфера, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха. Затем установите клетку Фарадея над системой и приложите внешнее давление, как описано в текстовом протоколе. После помещения 40 µL калибровочных частиц в верхнюю жидкостную ячейку проведите измерение TRPS при трех значениях приложенного напряжения.

Измените напряжение, нажимая кнопки «плюс» и «минус» на шкале напряжения во вкладке настроек прибора в программном обеспечении. Убедитесь, что при трех значениях напряжения фиксируются соответствующие фоновые токи. Также убедитесь, что при среднем напряжении калибровочные частицы создают среднюю величину блокады не менее 0.3 nanoamperes.

После достижения условий, описанных в текстовом протоколе, запустите процесс, нажав кнопку start во вкладке сбора данных (data acquisition) в программном обеспечении. Для завершения измерения нажмите stop во вкладке сбора данных и сохраните файл с данными. Промойте систему, несколько раз заменив калибровочные частицы 40 µL буфера PBST в верхних жидкостных ячейках.

Применяйте различные значения давления до тех пор, пока не исчезнут события блокировки, чтобы убедиться в отсутствии остаточных частиц и перекрестного загрязнения. После достижения соответствующего базового тока замените электролит в верхней жидкостной ячейке 40 µL образца. Запустите анализ образца, нажав кнопку «start» во вкладке сбора данных.

Зарегистрируйте не менее 500 частиц и убедитесь, что время прогона составляет не менее 30 секунд. Для завершения измерения нажмите кнопку stop во вкладке сбора данных и сохраните файл данных. Здесь приведен пример анализа размера и дзета-потенциала частиц, покрытых стрептавидином без модификаций, и частиц, покрытых стрептавидином, поверхность которых насыщена одноцепочечной ДНК.

Несмотря на то что оба образца имели схожий размер, дзета-потенциал существенно различался и был значительно выше в случае функционализации поверхности частиц ДНК. Здесь представлены данные о размере и дзета-потенциале для образцов с наименьшей и наибольшей концентрациями ДНК, гибридизованной с частицами, покрытыми стрептавидином. Более высокое значение дзета-потенциала регистрируется для частиц, гибридизованных с более высокой концентрацией ДНК.

Здесь показано изменение дзета-потенциала, измеренное только для захватывающей зондовой ДНК, полностью комплементарной ДНК-мишени, ДНК-мишени со связыванием посередине, ДНК-мишени со связыванием на конце и ДНК-мишени с нависающим концом. После освоения эта методика может быть выполнена за 20 минут при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательной промывки нанопоры между каждой калибровкой и образцом, чтобы исключить перекрестное загрязнение образцов и предотвратить закупорку нанопоры.

После своей разработки этот метод открыл исследователям в области биосенсоров путь к изучению белок-белковых и белок-ДНК взаимодействий в мультиплексных анализах. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять дзета-потенциал с помощью TRPS и подготавливать модифицированные ДНК частицы для биоанализов.