Измерение In Vitro Интеграция активность ВИЧ-1 Preintegration Комплексы

Общая цель этой процедуры заключается в измерении in vitro интеграционной активности преинтеграционных комплексов, или PICs, выделенных из инфицированных ВИЧ-1 клеток SupT1. Этот метод ответит на некоторые ключевые вопросы биологии ВИЧ, в частности, на то, как определенные факторы хозяина и вирусные факторы, например, вирусный капсид, играют роль в интеграции ДНК ВИЧ-1, и это поможет нам разработать или определить новые мишени для антиретровирусной терапии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он требует относительно небольшого количества прединтеграционного комплекса (PIC) для измерения интеграционной активности in vitro.

Применение этого метода может распространяться как на диагностику, так и на терапию ВИЧ-1 СПИДа, и это связано с тем, что более ранние версии этого метода сыграли решающую роль в открытии ингибиторов интегразы ВИЧ-1, которые являются одним из основных препаратов против ВИЧ в клиническом использовании на сегодняшний день. но он также может быть применен для изучения других ретровирусов, таких как RSV и MLV. Демонстрировать этот протокол будет доктор Мутукумар Баласубраманиам, который является научным сотрудником лаборатории с докторской степенью. Чтобы заразить SupT1 ВИЧ-1, в лаборатории BSL-2 поддерживайте клетки SupT1 в диапазоне от одного до двух раз от 10 до шестой клетки на миллилитр в Мемориальном институте Розуэлл Парк или в среде RPMI с добавлением 10% FBS и Pen-Strep.

После получения высоких титров инфекционного ВИЧ-1 в соответствии с текстовым протоколом объедините клетки SupT1 из колб с культурами, хорошо перемешайте пипетированием и используйте окрашивание трипановым синим цветом в гемоцитометре для определения количества жизнеспособных клеток. Аликвот восемь раз по 106 клеток на вирусную инфекцию в 50-миллилитровых конических центрифужных пробирках, затем центрифугируйте клетки в качающемся роторе при температуре 500 g и 25 градусах Цельсия в течение пяти минут. Не удаляя питательную среду для клеточных клеток, перенесите пробирки, содержащие гранулированные клетки, в лабораторию BSL-3 для дальнейшей обработки, затем осторожно отасадите среду из пробирки, не повреждая гранулу.

Далее добавьте в клетки 30 миллилитров обработанного мною вируса инокулята ДНКазы и перемешайте с помощью аккуратного пипетирования, после чего равномерно распределите смесь между двумя шестилуночными планшетами для культивирования тканей. Для спинокуляции поместите культуральные планшеты в держатели планшетов и центрифугируйте в качающемся роторе ведра при 480 g и 25 градусах Цельсия в течение двух часов, затем инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение пяти часов. Чтобы собрать и лизировать инфицированные клетки, объедините клетки, соответствующие каждой инфекции, в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.

Центрифугируйте клетки при 300 умножении g и 25 градусах Цельсия в течение 10 минут, затем тщательно отсасывайте или пипетируйте надосадочную жидкость. Чтобы удалить остатки вирусных частиц, промойте каждую гранулу, добавив два миллилитра буфера К минус минус и снова закрутите образец, затем, не тревожа гранулу, осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации или с помощью пипетки перед повторением промывки еще раз. После тщательного удаления остатков буфера с помощью микропипетки используйте ледяной буфер для лизиса K plus plus, чтобы аккуратно повторно суспендировать каждую гранулу и переложить в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.

Чтобы приготовить цитоплазматические комплексы предварительной интеграции, или ФИС, покачивайте образец при комнатной температуре в течение 10 минут, затем поместите пробирки в ротор, предварительно охлажденный до четырех градусов Цельсия, и центрифугируйте при 1500 g и четырех градусах Цельсия в течение четырех минут. Не потревожив гранулу, осторожно переложите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку и вращайте при 16 000 g и четырех градусах Цельсия в течение одной минуты. Осторожно переложите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку, затем добавьте РНКазу А до конечной концентрации 20 мкг на миллилитр, и инкубируйте содержимое при комнатной температуре без раскачивания в течение 30 минут.

Добавьте сахарозу до конечной концентрации 7% и хорошо перемешайте с помощью осторожного пипетирования, затем приготовьте аликвоты ФИС в микроцентрифужных пробирках. Мгновенно заморозьте в жидком азоте и поместите в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения. Чтобы получить целевую ДНК, используемую в интеграции in vitro или анализе IVI, соберите смеси ПЦР для амплификации области 2,0 килооснования из плазмидной ДНК phiX174 с использованием специально изготовленных праймеров phiX174-Forward и phiX174-Reverse и проведите ПЦР с использованием программы в соответствии с текстовым протоколом.

После очистки гелем и аликвотирования образца добавьте 600 нанограммов целевой ДНК к 200 микролитрам ФИС. Хорошо перемешайте и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут. Остановите реакцию IVI добавлением SDS, ЭДТА и протеиназы К, затем тщательно перемешайте содержимое реакции и инкубируйте при температуре 56 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день, чтобы очистить общую ДНК от реакции IVI, добавьте равное количество фенола к депротеинизированному образцу. Энергично перемешайте с помощью вортекса и центрифугируйте в течение двух минут. Осторожно удалите верхнюю водную фазу и переложите ее в свежую пробирку перед повторением экстракции фенола, затем добавьте равный объем одного к одному фенолхлороформу.

Перемешайте образец с помощью вортекса и центрифугируйте пробирку в течение двух минут, затем перенесите верхнюю водную фазу в свежую пробирку. После экстракции хлороформом согласно текстовому протоколу осадите ДНК из водной фазы, добавив 0,1 мкг на микролитр гликогена, 0,3 моляра ацетата натрия и 2,5 объема ледяного 100% этанола. Поместите пробирку при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь.

На следующий день центрифугируйте образец при 16 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, затем осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу. Чтобы провести ПЦР для количественной оценки активности PIC, начните с первого раунда обычной ПЦР с использованием праймеров, нацеленных на вирусный LTR и ДНК phiX174 для амплификации соединений интегрированной ДНК HIV-1. Соберите мастер-смесь за вычетом матричной ДНК, как описано здесь, затем распределите 45 микролитров аликвот в отдельные пробирки для ПЦР и добавьте пять микролитров матричной ДНК или воды без нуклеазы в качестве контроля.

Запустите реакцию в амплификаторе с помощью программы, изложенной в текстовом протоколе, затем проведите второй раунд количественной ПЦР и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом. В этом анализе ИВН SupT1 подвергали спинокулированию с ДНК-1, обработанной ВИЧ-1, и отсутствием или присутствием ингибитора интегразы ВИЧ-1, ралтегравира. После инкубации PICs были выделены, а очищенная ДНК проанализирована на предмет интеграции вирусной ДНК.

Как показано на рисунке, PICs HIV-1 надежно интегрируют ассоциированную вирусную ДНК в целевую ДНК, и эффективность IVI PIC PICs была значительно снижена в реакциях с добавлением ралтегравира, что сильно связывает интеграционную активность, измеренную в этом анализе, с интегразой HIV-1. Контрольные реакции не показали какой-либо интеграционной активности. Кроме того, контроль, исключающий Taq-полимеразу в первом раунде ПЦР, не амплифицировал продукты интеграции.

Примечательно, что данные только контрольных PICs указывали на то, что вложенная стратегия количественной ПЦР измеряла именно интегрированную вирусную ДНК, но не PIC-ассоциированную вирусную ДНК. В совокупности эти данные демонстрируют связанную с PIC-интеграцией интеграционную активность. После освоения препарат вируса и ПЦР-анализы для количественного определения активности ПОС могут быть завершены в течение недели.

Инфицирование клеток SupT1 и выделение PICs из инфицированных клеток может быть выполнено в течение дня. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять PICs HIV-1 и измерять активность интеграции in vitro. Не забывайте, что работа с высокими титрами инфекционного ВИЧ-1 может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать соответствующие меры предосторожности, включая защитную одежду, такую как фартуки и халаты, двойные перчатки и защитные очки.