Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета

Общая цель данной методологии ELISpot заключается в том, чтобы обеспечить количественную оценку В-клеток, секретирующих антитела человека, из крови. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биомедицинской области об иммунологии В-клеток и исследованиях вакцин. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет обнаруживать и измерять В-клетки, секретирующие антитела, на уровне отдельных клеток.

Демонстрировать процедуру будет Цзун-Чи Ценг, аспирант из моей лаборатории. Сразу после взятия образца крови объемом 10 мл из срединной кубитальной вены в пробирку объемом 15 мл, содержащую ЭДТА с добавлением калия, несколько раз переверните пробирку, чтобы предотвратить образование тромба. Затем добавьте в клетки 35 мл буфера для лизиса автоклавированных эритроцитов для пятиминутной инкубации при комнатной температуре.

Когда через трубку можно будет наблюдать свет, центрифугируйте кровь и подтвердите наличие белой гранулы. Удалите остаточный буфер для лизиса с помощью 10 мл автоклавного PBS и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл среды RPMI 1640. Поместите клетки в 10-сантиметровую чашку для инкубации в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа.

Затем осторожно переверните чашку для культуры несколько раз и перенесите плавающие клетки в пластиковую коническую трубку объемом 15 мл. После двух промывок центрифугированием повторно суспендируйте гранулу в концентрации от 5 до 10 десятых от шести клеток на мл в 200 микролитрах холодного буфера PBS и добавьте 5 микролитров биотинилированного коктейля антител к человеку, специфичного для клеток крови, на одну десятую часть шестой клетки. После 30-минутной инкубации на льду промойте клетки в 10-кратном избыточном объеме стерильного PBS и повторно суспендируйте гранулу в пяти микролитрах стрептавидина, конъюгированных микрогранулами в расчете на одну десятую из шести клеток, для 30-минутной инкубации на льду.

В конце инкубации добавьте в клетки два мл буфера PBS и поместите пробирку на магнитную подставку на восемь минут при комнатной температуре. Когда микрошарики прикрепятся к стенке пробирки, осторожно переложите надосадочную жидкость в новую коническую пробирку и добавьте в ячейки еще 2 мл PBS буфера. После второго сбора надосадочной жидкости соберите объединенные клетки центрифугированием и перенесите клетки в полистирольную пробирку объемом пять мл и свежий буфер PBS в концентрации, умноженной на одну десятую от семи клеток на мл.

После предварительного формования неспецифической блокировки добавьте в пробирку по одному микрограмму каждого отборочного антитела в расчете на одну десятую из шести клеток, осторожно перемешивая в течение 30-минутной инкубации на льду. В течение последних пяти минут инкубации добавьте в клетки пять микролитров 7-AAD. Затем добавьте два миллилитра свежего PBS в ячейки и сделайте вихрь перед центрифугированием.

Повторно суспендируйте гранулу в свежем сортировочном буфере в концентрации от одной до пяти десятых от семи ячеек на миллилитр и отфильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 микрон в новую пятимиллилитровую полистирольную трубку. Затем отсортируйте клетки с помощью проточной цитометрии в три пробирки по 15 мл, содержащие 5 мл свежей среды RPI, чтобы собрать наивные В-клетки, В-клетки памяти и плазматические плазматические клетки. Когда все клетки будут собраны, засейте субпопуляции в отдельные лунки 12-луночного клеточного планшета в концентрации от одной до десяти десятых пятой клетки на миллилитр в свежей среде RPMI.

Затем активируйте В-клетки пятью микрограммами CPG ODN 2006 в расчете на одну десятую часть шестой клетки на миллилитр на лунку в инкубаторе для клеточных культур в течение пяти дней. В конце активации добавьте 30 микролитров 35% этанола и дистиллированной воды в каждую лунку пластин ELISpot на 30 секунд. Затем замените этанол в каждой лунке 150 микролитрами автоклавной двойной дистиллированной воды и инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы удалить остатки этанола.

Проведите промывку PBS с последующим добавлением в каждую лунку 50 микролитров поликлонального фрагмента FAB2 античеловеческого иммуногломерата. Вымойте тарелки два раза с PBS, как только что показано. Закройте неспецифическое связывание в каждой лунке 200 микролитрами свежего PBS с BSA на два часа при комнатной температуре.

После очередной серии промывки PBS инкубируйте лунки в 100 микролитрах свежей среды RPMI 1640 при температуре 37 градусов Цельсия. Затем замените среду в каждой лунке ELISpot на соответствующее количество активированных В-клеток. Доведите окончательный объем каждой лунки до 150 микролитров с помощью свежей среды RPMI, затем верните планшет ELISpot в инкубатор для клеточных культур на восемь-14 часов.

По окончании инкубационного периода выбросьте среду и промойте лунки 200 микролитрами PBS плюс tween20 в течение пяти, трех минутных промывок. После последней промывки добавьте соответствующие антитела обнаружения в соответствующие лунки и инкубируйте пластины в течение двух часов в темноте. После очередной серии промывки PBS добавьте по 50 микролитров субстрата BCIPMBT в каждую лунку на пять-15 минут при комнатной температуре.

При появлении фиолетовых пятен остановите реакцию 100 микролитрами дважды дистиллированной воды на лунку и промойте пластину проточной водой из-под крана. Затем просушите мембрану ELISpot на воздухе, защищенную от света. В этом донорском образце PBMC после лизиса эритроцитов и истощения адгезивных клеток около 10 процентов лимфоцитов были CD19-положительными В-клетками.

В компартменте В-клеток около 50 процентов составляли CD27-отрицательные наивные В-клетки, а 50 процентов — CD27-экспрессирующие В-клетки памяти. Обработка CPG очищенных В-клеток человека и CD19+CD27+ в течение пяти дней, как только что продемонстрировано, обычно приводит к генерации от 50 до 200 IgM и от 10 до 50 антител, секретирующих антитела от одного до десяти до четвертого активированных В-клеток. После освоения эта техника ELISpot может быть завершена за три часа, если она выполнена правильно.

Перед началом этой процедуры важно не забыть закодировать место с помощью соответствующих реагентов захвата для обнаружения клеток, секретирующих антитела. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области вакцинологии к изучению эффективности вакцины в крупномасштабных испытаниях и длительных последующих наблюдениях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очистить В-клетки человека из крови.

Отделите наивные В-клетки и В-клетки памяти для их дифференцировки и выполните эссе ELISpot для квалификации клеток, секретирующих антитела. Не забывайте, что работа с человеческой кровью может быть опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.