Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы использовать контроль качества сворачивания пути транслокации твин-аргинина для создания связывания фрагментов антител и внутриклеточного сворачивания за один этап, что будет иметь применение в инженерии антител для внутриклеточного функционирования. Этот метод может помочь преодолеть ключевые проблемы в области инженерии антител, такие как преодоление трудностей в разработке антител, которые сворачиваются и функционируют должным образом в восстановительной цитоплазматической среде. Только антитела, которые хорошо сворачиваются в цитоплазме, отображаются и анализируются на связывание.

Это дает преимущество перед дрожжевыми и фаговыми дисплеями, которые полагаются на секреторные пути для отображения. Применение этого метода распространяется на нашу терапию нейродегенеративных заболеваний, рака и вирусных инфекций, поскольку эти заболевания включают внутриклеточный патогенез, на который могут нацеливаться антитела. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что понимание того, как генерировать сферопласты и работать с ними, является сложной задачей.

После объединения библиотеки scFv с сигнальной последовательностью ssTorA и увеличения ее до 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение трех часов, позвольте экспрессии библиотеки scFv при 20 градусах Цельсия и 225 об/мин в течение ночи в течение 15-22 часов. После инкубации с помощью спектрофотометра измерьте оптическую плотность на глубине 600 нанометров. Затем центрифугируют рассчитанный объем индуцированной культуры в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров при 12 000 г и комнатной температуре в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость и используйте 100 микролитров ледяного фракционирующего буфера или fB для ресуспендирования гранул. Затем центрифугируйте образцы при 12 000 умноженных на g и комнатной температуре в течение одной минуты. После удаления надосадочной жидкости используйте 350 микролитров ледяного fB с добавлением 3,5 микролитров 10 миллиграммов на миллилитр лизоцима для ресуспендирования гранул.

Затем, медленно перекручивая пробирки, добавьте по каплям 700 микролитров 1 миллимолярного ЭДТА, затем инкубируйте пробирки на ротаторе пробирок при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы перемешать образцы. Извлеките трубки из ротатора. Добавьте 50 микролитров ледяного пятикоренного MgCl2 в каждую пробирку и инкубируйте их на льду в течение 10 минут.

Затем центрифугируйте образцы при 11 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Теперь с помощью микропипетки и наконечника объемом в один миллилитр медленно потяните вверх часть гранулы. Затем, удерживая трубку, под углом с отверстием прямо над новой трубкой объемом 1,5 миллилитра, медленно поднимите наконечник пипетки из надосадочной жидкости и вставьте гранулу в новую трубку.

После удаления избытка надосадочной жидкости используйте один миллилитр ледяного PBS для ресуспендирования сферопластов. Сферопласты должны быть полностью суспендированы перед промывкой, поскольку несвязывающиеся scFv, присутствующие в агрегатах, приведут к ложноположительным результатам панорамирования. После биотинилирования целевого антигена в соответствии с текстовым протоколом ресуспендируйте магнитные шарики, покрытые стрептавидином, в их исходный флакон.

Затем переложите семь-10 умножить на 10-9-е бусины в тубу объемом 1,5 миллилитров. Поместите пробирку с шариками на магнитный штатив на две минуты, чтобы собрать шарики на боковой стороне пробирки, и пипеткой, чтобы аккуратно удалить надосадочную жидкость. Снимите трубку с магнита и используйте PBS для повторного взвешивания шариков, не образуя пузырей.

Затем верните трубку к магниту и снимите буфер перед тем, как промыть бусины еще два раза PBS. Добавьте в шарики один миллилитр лизата, содержащего биотинилированный антиген, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, осторожно вращая. После инкубации используйте PBS с 1% BSA, чтобы промыть бусины пять раз.

Затем используйте PBS с 1% BSA для ресуспензии валиков. Чтобы просмотреть библиотеку scFv, начните с добавления четырех раз по 10 к 9-му сферопласту и восемь раз по 10 к 8-му шарику в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Добавьте один x PBS с 1% BSA, чтобы довести общий объем до четырех миллилитров.

Затем разлейте раствор в четыре пробирки объемом 1,5 миллилитра по одному миллилитру каждая и инкубируйте реакции при температуре четыре градуса Цельсия, осторожно вращая в течение пяти часов. Чтобы подготовить сферопласты, связанные шариками, к ПЦР, поместите пробирки для продувочной реакции на магнит на три минуты. Удалите надосадочную жидкость и промойте шарики одним x PBS с 1% BSA четыре раза, как и раньше.

Затем используйте 25 микролитров ddH20 на пробирку для ресуспензии шариков. Как описано в текстовом протоколе, проведите ПЦР с цельной плазмидой для амплификации генов scFvs, связанных с бусинами, а затем рециркуляризуйте плазмиду из продукта ПЦР. Преобразуйте всю реакцию в выровненные клетки MC4100 в соответствии с текстовым протоколом.

Чтобы идентифицировать клоны с помощью ИФА, разморозьте одну пробирку подбиблиотеки panned и планшет на агаровых пластинах LB. Добавьте 200 микролитров LB с 20 микрограммами на миллилитр хлорамфеникола в каждую лунку круглого дна 96-луночной питательной пластины. С помощью наконечника для пипетки выберите отдельную колонию из агаровой пластины.

Затем поместите наконечник в первую лунку 96-луночной пластины и осторожно перемешайте для прививки. Продолжайте вводить по одной колонии в каждую лунку. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20–24 часов в вибростенде.

После приготовления целевого антигенного покрытия раствора в соответствии с текстовым протоколом добавьте по 50 микролитров раствора в каждую лунку 96-луночной пластины из прозрачного полистирола ИФА с высокой связующей связью. Инкубируйте пластины при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Затем реплицируйте колонии из 96-луночных планшетов для культивирования на агаровые планшеты в соответствии с текстовым протоколом.

Затем слейте раствор для покрытия с планшетов ИФА и добавьте в каждую лунку по 100 микролитров блокирующего раствора, приготовленного по текстовому протоколу. Инкубируйте при комнатной температуре не менее двух часов или при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Добавьте по 20 микролитров концентрированного детергента для лизиса клеток в каждую лунку культуральной пластины с круглым дном и инкубируйте культуральную пластину в вибростенде для микропланшетов при комнатной температуре в течение 15-20 минут.

Слейте блокирующий раствор с планшетов ИФА и четыре раза промойте лунки 200 микролитрами промывочного буфера, приготовленного в соответствии с текстовым протоколом. После удаления окончательной промывки перенесите по 50 микролитров из каждой лунки планшета для лизиса клеток в соответствующую лунку планшета для ИФА. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение одного-двух часов.

Приступайте к опорожнению образцов с планшета ИФА и промойте лунки четыре раза. После этого приготовьте раствор антитела для обнаружения scFvs в соответствии с текстовым протоколом. Добавьте по 50 микролитров антитела в каждую лунку и инкубируйте в течение одного-двух часов при комнатной температуре.

Промыть пластины ИФА четыре раза с помощью промывочного буфера перед добавлением 200 микролитров на лунку подложки HRP, приготовленной в соответствии с протоколом производителя. Выдерживайте пластины в темноте при комнатной температуре от 30 до 60 минут. Чтобы погасить реакцию, добавьте в каждую лунку по 50 микролитров трех моляров H2SO4 и аккуратно пипеткой перемешайте раствор.

Наконец, измерьте поглощение с помощью пластины, показывающей 492 нанометра. В этом эксперименте были использованы антитела scFv13 и scFv13. R4 были слиты либо с нативной последовательностью ssTorA, либо с модифицированным ssTorA, который не распознается путем транслокации близнец-аргинина, также называемым путем Tat.

R4 хорошо сворачивается и экспрессируется на внутренней мембране при введении в нативный ssTorA. ScFv13 плохо сворачивается и не отображается на внутренней мембране независимо от того, с каким сигнальным пептидом Tat он слит. Эти результаты демонстрируют, что на внутренней мембране отображаются только белки, которые содержат пептид сигнала Tat и правильно свернуты в цитоплазме, что позволяет пути Tat функционировать в качестве экрана для внутриклеточного сворачивания.

В этом эксперименте подверженная ошибкам ПЦР-библиотека на основе scFv13, которая имеет низкий уровень аффинности связывания с бета-галактозидазой, была исследована против бета-галактозидазы. ScFv 1-4 был выделен и продемонстрировал более высокое сродство связывания с бета-галом, чем scFv13, а также более высокий уровень растворимости цитоплазмы. Используя scFv 1-4 в качестве конкурента по сравнению с библиотекой scFv 1-4 второго поколения, scFv 2-1 и 2-3 были выделены и продемонстрировали еще более высокое сродство связывания с бета-галом, чем scFv13 1-4, что подчеркивает одновременную инженерию растворимости и связывания антигена.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ИФА с использованием очищенного лизата, чтобы проверить специфичность антигена и определить аффинность связывания изолированных клонов. После просмотра этого видео вы должны понять, как провести скрининг антитела на связывание с интересующим вас антигеном с помощью пути Tat для отображения этой библиотеки и магнитного панорамирования шариков для обогащения и изоляции связывающих антиген веществ. Не стоит забывать, что работа с серной кислотой может быть крайне опасной и необходимо носить надлежащие средства индивидуальной защиты.