Эффективная спороношение Saccharomyces CEREVISIAE В 96-луночные Format

Общая цель этого протокола заключается в эффективном спорулировании дрожжей в формате 96 лунок. Несмотря на то, что было проведено множество крупномасштабных скринингов на почковающихся дрожжах, высокопроизводительные исследования, изучающие мейоз и спороношение, были ограничены. Преимуществом метода, описанного в этом видео, является эффективное и экономичное спорообразование дрожжей в формате на 96 лунок, совместимом с высокопроизводительным скринингом.

Идея этого метода пришла мне в голову, потому что я хотел использовать двухмикронную библиотеку плазмид для скрининга мутантов с высоким уровнем копирования, которые не могут образовывать рефракционные споры. Первоначально эффективность спороношения была низкой в формате 96 лунок. Я обнаружил, что это связано с недостаточной аэрацией.

Начните эту процедуру с размораживания штамма дрожжей SK1 на дрожжевом экстракте, пептон-глицерине или пластине YPG. С помощью стерильной палочки соскребите небольшое количество клеток из флакона морозильной камеры, содержащего запасы глицерина, и распределите их на пластине YPG. Выращивайте дрожжи от 12 до 16 часов при температуре 30 градусов Цельсия.

Затем нанесите дрожжи с планшета YPG на пластину с пептон-декстрозой дрожжевого экстракта, или YPD, для отдельных колоний. Выращивайте дрожжи на планшете YPD в течение 24-48 часов при температуре 30 градусов Цельсия. После 24–48 часов роста на твердой среде YPD начните выращивать культуру YPD объемом 25 миллилитров, используя одну колонию из планшета YPD.

Выращивайте эту культуру в течение ночи в инкубаторе с встряхиванием при температуре 30 градусов Цельсия при 220 об/мин, пока клетки не достигнут OD600 от 4,0 до 7,0. На следующий день используйте соответствующее количество клеток из культуры YPD, чтобы начать культивирование 125 мл в пептон-ацетате дрожжевого экстракта, или YPA, с OD600 0,1. Выращивайте культуру в инкубаторе с встряхиванием при температуре 30 градусов Цельсия при 220 об/мин до тех пор, пока OD600 не составит от 1,3 до 1,5.

Переложите культуру в центрифужные пробирки и вращайте при 1800X G в настольной центрифуге в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Промойте клетки один раз 0,5 объема стерильной автоклавированной деионизированной воды. Снова вращаем и сбрасываем воду.

Ресуспендируйте клетки в 1X объеме споруляционной среды. Для получения клеток различных генотипов клетки из размороженных замороженных запасов в 96-луночной многолуночной пластине сначала переносятся на твердые среды YPG. Разожгите лягушку с 96 зубцами, а затем мгновенно охладите ее на пластине с твердой средой, прежде чем прикоснуться к колониям дрожжей.

Выращивайте дрожжи в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия. На следующий день перенесите клетки из твердых сред YPG в YPD или селективные твердые среды, в зависимости от генотипа штамма. В этой демонстрации используется YPD.

Выращивайте дрожжи при температуре 30 градусов Цельсия до тех пор, пока не сформируются колонии для каждого штамма. Внесите 1,2 миллилитра жидкой среды YPD в каждую лунку на 96-метровой луночной пластине. Переведите элементы из твердых сред в жидкие.

Накройте тарелку пластиковой крышкой из прямоугольной пластины Петри и удерживайте крышку на месте с помощью куска скотча, чтобы минимально ограничить циркуляцию воздуха. Выращивайте клетки в течение ночи в вибростенде с температурой 30 градусов Цельсия при 220 оборотах в минуту. На следующий день центрифугируйте при 1800X G в течение пяти минут.

Слейте фильтрующий материал и добавьте в каждую лунку по 500 микролитров YPA. И повторно суспендировать оболваненные клетки. Накройте тарелку пластиковой крышкой, удерживаемой на месте скотчем.

Выращивайте клетки в течение 15 часов в инкубаторе с встряхиванием при температуре 30 градусов Цельсия при 220 оборотах в минуту. Чтобы обеспечить надлежащую аэрацию для эффективного спорообразования, добавьте в каждую лунку 96-луночного планшета либо одну трехмиллиметровую стерильную твердую стеклянную бусину, либо стерильную магнитную мешалку размером пять на два миллиметра. Если все клетки имеют один и тот же генотип, добавьте 500 микролитров клеток плюс среда в каждую лунку 96-луночного планшета.

Накройте тарелку пластиковой крышкой, удерживаемой на месте скотчем. Если клетки имеют разные генотипы, вращайте клетки, которые находятся в YPA, при 1800X G в течение пяти минут и слейте среду. Добавьте в каждую лунку по 500 микролитров среды для спороношения.

И ресуспендировать гранулированные клетки в спороносной среде. Накройте тарелку пластиковой крышкой, удерживаемой на месте скотчем. Если вы используете стеклянные шарики, поместите образцы в встряхивающий инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия и встряхивайте со скоростью 220 об/мин для спороношения.

Если вы используете магнитные мешалки, поместите образцы на перемешивающую пластину внутри инкубатора с температурой 30 градусов Цельсия для спорообразования. Точная скорость перемешивания магнитных стержней не очень важна, если все стержни движутся энергично, а культура аэрируется. Через 36 часов извлеките образцы, чтобы отслеживать прогрессирование спороношения.

Извлеките шесть микролитров клеток из каждой спорулирующей культуры и добавьте к 24 микролитрам споруляционной среды в 96-луночный покровный стакан. Оставьте клетки отстояться на пять минут, прежде чем осмотреть их с помощью инвертированного микроскопа. Репрезентативная споруляция двух различных штаммов показана на этих изображениях клеток, визуализированных с помощью объектива 63X на инвертированном микроскопе.

Рефрактильные тетрады, обозначенные наконечниками стрел, можно увидеть в культуре дикого типа. Но не в культуре, содержащей клетки smk1 с дефицитом споруляции. Сравнивали эффективность спорообразования от клеток, спорулированных в многолуночных планшетах, и клеток, спорулированных с использованием больших объемов в колбах.

Использование многолуночных планшетов не позволило достичь высокой эффективности, обычно наблюдаемой при использовании более типичного протокола спороношения в колбах. Спорообразование в многолуночных планшетах с правильной аэрацией позволяет достичь достаточной эффективности спорообразования более 50%, при этом наилучшие результаты достигаются при использовании пятимиллиметровой мешалки. Однако, учитывая высокую стоимость небольших мешалок, эффективность, полученная при использовании стеклянных шариков, сопоставима.

Несмотря на то, что пятимиллиметровые и семимиллиметровые мешалки помещаются в лунку 96-луночного планшета, использование семимиллиметрового перемешивающего стержня привело к низкой эффективности спорообразования. Семимиллиметровый перемешивающий стержень в лунке имеет тенденцию взаимодействовать с перемешивающим стержнем в соседнем колодце. Предотвращение надлежащего перемешивания батончиков и обеспечение достаточной аэрации культуры.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как эффективно спорулировать дрожжевые клетки в жидкой культуре в формате 96 лунок. После освоения этот процесс может быть завершен за шесть дней, если все сделано правильно. Эта процедура может быть использована для скрининга различных мутантных штаммов, плазмид или низкомолекулярных ингибиторов на их влияние на мейоз и спорообразование.

После его разработки этот метод был использован для изучения регуляции мейотического клеточного цикла и того, как цитокинез и мейоз связаны в споруляции у Saccharomyces cerevisiae.