Экспресс-анализ циркадных фенотипы в Arabidopsis протопластов трансфицируют Люминесцентные Clock Reporter

Общая цель этого анализа заключается в определении циркадного периода в линиях Arabidopsis путем измерения люминесценции, испускаемой трансфицированными протопластами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области циркадной биологии, например, какие гены возвращаются в сам механизм хронометража. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет быстро анализировать циркадный период любого мутанта Arabidopsis без необходимости создания стабильных трансгенных линий.

Чтобы начать эту процедуру, наклейте этикетку на чашку Петри и добавьте в нее 10 миллилитров отфильтрованного стерилизованного ферментного раствора. Закрепите четыре полоски автоклавного скотча липкой стороной вверх на чистой лабораторной поверхности и отметьте на полосках размер чашки Петри. Соберите планы из комнаты роста.

Срежьте листья четырехнедельных растений и прижмите верхний эпидермис к автоклавной ленте так, чтобы нижняя поверхность эпидермиса была обращена вверх. Наклейте полоски волшебной скотчевой ленты на нижнюю поверхность эпидермиса. С помощью конической трубки объемом 15 миллилитров аккуратно прижмите полоски к листьям, стараясь не раздавить ткань листа.

Осторожно снимите ленту, чтобы обнажить нижний эпидермис и обнажить клетки мезофилла. Затем разрежьте автоклавную ленту по размеру чашки Петри и с помощью пинцета переместите ленту в чашку Петри и поместите ее на раствор фермента листьями вниз. Вращайтесь со скоростью 60 об/мин на платформенном вибростенде в течение 60 минут, в течение которых протопласты будут высвобождены в раствор.

Через 60 минут с помощью пинцета снимите и выбросьте полоски автоклавного скотча. С помощью наконечника пипетки с широким отверстием пипетка нанесите раствор, содержащий протопласты, в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте протопласты при 100 гГ в течение трех минут при четырех градусах Цельсия, и осторожно удалите надосадочную жидкость, так как гранула очень рыхлая.

Добавьте 10 миллилитров раствора W5 в протопласты и восстановите суспендию, аккуратно поворачивая трубку. Удалите аликвоту протопластов для подсчета. Отдохните протопласты на льду от 30 до 60 минут.

Пока протопласты находятся на льду, оцените выход, подсчитав протопласты в гемоцитометре. Соберите протопласты центрифугированием при 100 г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Удаляйте надосадочную жидкость с осторожностью, так как гранулы очень рыхлые.

Наконец, ресуспендируйте протопласты в растворе MMg до концентрации 500 000 протопластов на миллилитр. Начните процедуру трансфекции протопластов с добавления десяти микролитров репортерной плазмиды в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, а затем 400 микролитров протопластов. Добавьте один объем раствора полиэтиленгликоля или ПЭГ и перемешайте, осторожно перевернув трубку 12 раз, чтобы трансфектировать протопласты.

Выдерживайте от восьми до 15 минут при комнатной температуре. Протопласты должны инкубироваться достаточно долго, чтобы обеспечить эффективную трансфекцию, но не слишком долго, так как это снизит их жизнеспособность. Затем разбавьте смесь протопластов ДНК ПЭГ четырьмя объемами раствора W5 и перемешайте, слегка перевернув шесть раз.

Соберите трансфицированные протопласты центрифугированием при 100 г в течение двух минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, опять же соблюдая большую осторожность, так как гранула очень рыхлая. Ресуспендируйте протопласты в 1 250 микролитрах раствора для визуализации.

Протопласты должны довольно легко ресуспендировать, что указывает на то, что они не повреждены после трансфекции. Внесите 200 микролитров на лунку в шесть повторяющихся лунок 96-луночного планшета, а все пустые лунки заполните раствором W5. Запечатайте пластину клейкой прозрачной крышкой, подходящей для люминесцентной визуализации.

Чтобы получить изображение протопластов, перенесите 96-луночный планшет в любую люминесцентную установку, подходящую для визуализации растений. Смените клейкую крышку на плите через 10–15 минут после переноса, чтобы избежать конденсации и перепадов давления между лунками. Начните создание образа.

Читайте на табличке каждые 45 минут в течение пяти дней при комнатной температуре. Затем проанализируйте результаты люминесценции с помощью любого программного обеспечения для анализа, например, Biological Rhythms Analysis Software System. Протопласты мезофилла, выделенные по этому протоколу, показаны на этом изображении с увеличением в 200 раз.

Пропласты дикого типа arabidopsis и мутант cca1/lhy были трансфицированы и визуализированы при постоянном освещении на планшетном считывателе в течение пяти дней. Как и ожидалось, период свободного протекания экспрессии генов, контролируемых часами, у этого мутанта сокращается. Напротив, период циркадных колебаний в протопластах мутанта ztl удлиняется.

У протопластов с избыточной экспрессией CCA1 не наблюдалось колебаний экспрессии репортерной конструкции, поскольку чрезмерная экспрессия CCA1 приводит к аритмии. На этой гистограмме показаны оценки циркадного периода, основанные на следах люминесценции в протопластах дикого типа и часовых мутантах. Эти циркадные периоды согласуются с опубликованными данными, полученными от целых растений с использованием трудоемких трансгенных подходов.

При попытке выполнить эту процедуру важно использовать здоровые растения и обращаться с протопластами осторожно, так как они хрупкие. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделять, трансфектировать и визуализировать протопласты Arabidopsis.

Эти методы теперь могут быть применены к любой мутантной линии или даже модифицированы для получения изображений протопластов других видов растений.