Применение pHluorin для количественного, Kinetic и высокой пропускной способностью анализа эндоцитоза у почкующихся дрожжей

Общая цель данной процедуры заключается в количественной оценке процессов везикулярного транспорта в эндоцитозном пути живых клеток. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области везикулярного транспорта, такие как влияние мутаций или изменений в экспрессии белков на скорость и эффективность транспортных событий. Основным преимуществом данной методики является возможность прямой количественной оценки эндоцитозного транспорта в живых клетках путем измерения интенсивности флуоресцентно меченных белков-грузов.

После приготовления растворов и сред согласно текстовому протоколу инокулируйте две или три колонии дрожжевых клеток в пять миллилитров среды YNB, не содержащей дополнительных питательных веществ для поддержания селекции плазмид. Культивируйте культуры при 30 °C с встряхиванием в течение 16–24 часов. Примерно за три часа до визуализации измерьте OD 600 каждой ночной культуры.

Затем приготовьте разведения объемом пять миллилитров с OD 600 от 0,35 до 0,4 в среде YNB, не содержащей дополнительных питательных веществ для поддержания плазмид, и инкубируйте при 30 °C с перемешиванием в течение трех часов. Во время инкубации предварительно установите температуру в экологической камере или на подогреваемом столике микроскопа на 30 °C. Подготовив стеклянный планшет на восемь лунок и предметное стекло с камерой для визуализации согласно текстовому протоколу, добавьте по 200 µL среды YNB без дополнительных питательных веществ для селекции плазмид в каждую лунку.

Когда культуры будут готовы, перенесите один миллилитр в микроцентрифужную пробирку и осадите клетки при 8, 000 RPM в течение двух минут. Затем удалите 975 µl супернатанта. Ресуспендируйте осадок клеток в оставшемся супернатанте.

Затем внесите по 2,5 µL клеточной суспензии в центр каждой лунки восьмилуночного планшета. Несколько раз пропипетируйте раствор для равномерного распределения клеток и оставьте их для оседания на 5–10 минут. Поместите предметное стекло с камерой на инвертированный флуоресцентный микроскоп, предварительно прогретый до 30 °C.

Затем, используя освещение в светлом поле, найдите участок с клетками. Добавьте 50 µL предварительно подогретой среды YNB, содержащей 100 µg/mL метионина, к 200 µL среды в лунке, чтобы получить конечную концентрацию метионина 20 µg/mL. Перед началом визуализации дайте клеткам стабилизироваться в течение двух минут.

Затем, непосредственно перед визуализацией, настройте микроскоп на нужную фокальную плоскость. Регистрируйте изображения GFP в светлом поле или в режиме DIC с интервалом в 5 минут в течение 45–60 минут, используя идентичные параметры регистрации для всех изображений в рамках одной временной серии.

Дополнительные сведения см. в текстовом протоколе. Определите интенсивность флуоресценции отдельных клеток в каждой временной точке и выразите значения как процент от начальной интенсивности первого изображения. После экспорта изображений в соответствии с текстовым протоколом в ImageJ откройте файлы через меню «File», используя опцию «Open».

Используйте флуоресцентное изображение для количественного анализа, а изображение в светлом поле или в дифференциально-интерференционном контрасте (DIC) — в качестве ориентира для определения местоположения клеток. Исключайте погибшие клетки, которые при DIC-визуализации выглядят темнее живых и проявляют автофлуоресценцию в канале GFP. Для изображений с неравномерным фоном в меню Process выберите алгоритм вычитания фона (background subtraction) и используйте настройки по умолчанию.

После получения изображений важно выполнить вычитание фона перед переходом к процедуре количественного анализа. Этот этап особенно важен, поскольку фоновый сигнал в противном случае может замаскировать или нивелировать различия между образцами. С помощью инструмента произвольного выделения обведите клетку, стараясь охватить ее целиком, но максимально ограничив выделение области вне клетки.

Затем в меню Analyze выберите функцию set measurements, чтобы измерить площадь, интегральную плотность и среднее значение серого цвета. Откройте ROI Manager, перейдя в Analyze, затем в Tools. В окне ROI Manager нажмите кнопку Add, чтобы добавить выделенную область как новый ROI.

Повторите обводку и снятие измерений для остальных клеток на изображении, исключая погибшие клетки или клетки, касающиеся края изображения. Сохраните выбранные области интереса (ROI) в виде zip-файла, нажав кнопку measure, после чего в новом окне отобразятся измеренные значения. Затем нажмите кнопку more и экспортируйте все измерения в электронную таблицу или программу для статистического анализа.

Инокулируйте две или три колонии дрожжевых клеток в 0,5 миллилитра среды YNB, не содержащей дополнительных нутриентов для поддержания селекции плазмид. Культивируйте клетки на ротационном барабане при 30 °C в течение 16–24 часов. Добавьте один миллилитр среды YNB без дополнительных нутриентов для поддержания плазмид и инкубируйте еще три часа.

Затем перенесите по 1 мл клеток в две пробирки с круглым дном объемом 5 мл. Затем добавьте 0,25 мл среды YNB Met в первую пробирку и 0,25 мл среды YNB, содержащей 100 мкг/мл метионина, во вторую пробирку, чтобы конечная концентрация составила 20 мкг/мл. При большом количестве образцов добавляйте метионин поэтапно, чтобы оставить время для анализа фактов.

Наш проточный цитометр позволяет анализировать до 40 образцов за один запуск. Мы добавляем метионин порциями: по восемь образцов каждые пять минут.

Это гарантирует, что все образцы будут измерены через 45–50 минут после добавления метионина. Инкубируйте клетки в течение 45 минут. Затем проанализируйте клетки методом проточной цитометрии, выбрав прямое светорассеяние (FS) в качестве показателя размера клеток, и зафиксируйте интенсивность флуоресценции через FITC-фильтр в качестве показателя интернализации груза.

В течение 45-минутной инкубации используйте ползунки для регулировки напряжения каналов FS и FITC, чтобы оптимизировать детектирование в соответствии с диапазоном размеров и интенсивностью флуоресценции используемых дрожжевых клеток. Измерьте FS и интенсивность флуоресценции для 10 000 клеток для каждого условия. Используя настройку высокой скорости потока, создайте диаграмму рассеяния FS относительно интенсивности флуоресценции, нажав кнопку «добавить график».

Затем выберите FITC для оси x и FS для оси y и отобразите 1000 точек. Используя функцию гейтирования и образец дикого типа Met, установите вертикальный гейт таким образом, чтобы примерно 5% самых ярких клеток находились справа от него. Используйте этот гейт для всех остальных условий в эксперименте.

Как показано здесь, таймлапс-визуализация клеток проводилась с пятиминутным интервалом в отсутствие или присутствии метионина для мониторинга интернализации Mup1, меченного GFP или флуоресцентной меткой, а также изменений флуоресценции. Как и ожидалось, Mup1 с метками GFP и флуоресцентом оставался на плазматической мембране в отсутствие метионина. Напротив, в клетках, визуализируемых в присутствии метионина, наблюдалось прогрессирующее снижение флуоресцентного сигнала с поверхности клетки, что соответствует интернализации груза.

Тем не менее, кинетика потери флуоресценции в присутствии метионина в клетках Mup1 GFP была замедлена по сравнению с клетками pHlourin Mup1. На этих диаграммах рассеяния сравнивается интенсивность флуоресценции клеток дикого типа или четырех линий клеток с делецией ENTH1 в присутствии или отсутствие метионина после применения вертикального гейта. 4% клеток дикого типа с метионином находились в правой части гейта, соответствующей самым ярким клеткам в популяции, в то время как в гейте находилось 65% необработанных клеток дикого типа.

Напротив, в четырех клетках delta ENTH1 не было выявлено различий в распределении ярких и тусклых клеток, что согласуется с нарушением эндоцитоза. После освоения эта методика может быть выполнена за три-четыре часа при соблюдении всех правил. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости смещать время начала одновременных экспериментов, чтобы конечные данные были собраны после одинакового времени воздействия для всех образцов.

После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как генетический скрининг цветков, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, какие новые факторы влияют на везикулярный транспорт. После разработки эта методика позволила исследователям в области везикулярного транспорта изучить аспекты деградации эндосом, а также недавно обнаруженный клатрин-независимый и кислый путь в почкующихся дрожжах. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать грузовые белки florent-типа для количественной оценки эндоцитоза в живых клетках.