Применение pHluorin для количественного, Kinetic и высокой пропускной способностью анализа эндоцитоза у почкующихся дрожжей

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке событий везикулярного транспорта в эндоцитарном пути живых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области везикулярного транспорта, такие как как мутация или изменения в экспрессии белка влияют на скорость и эффективность событий транспортировки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить прямую количественную оценку эндоцитарного транспорта и живых клеток путем измерения интенсивности флуоресцентно помеченных грузовых белков.

После приготовления растворов и сред согласно текстовому протоколу инокулировать две-три колонии дрожжевых клеток в пять миллилитров среды YNB, лишенных дополнительных питательных веществ для поддержания селекции плазмид. Выращивайте культуры при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием в течение от 16 до 24 часов. Примерно за три часа до визуализации измерьте наружный диаметр 600 для каждой ночной культуры.

Затем готовят пятимиллилитровые разведения с наружным диаметром 600 от 0,35 до 0,4 в среде YNB, не имея дополнительных питательных веществ для поддержания плазмиды, и выращивают при 30 градусах Цельсия с встряхиванием в течение трех часов. Во время инкубации микроскоп предварительно уравновешивают в камере окружающей среды или нагретом предметном столике до 30 градусов Цельсия. После подготовки обработанной восьмилуночной стеклянной кастрюли и камерного предметного стекла для визуализации согласно текстовому протоколу добавьте в каждую лунку по 200 микролитров среды YNB, в которой отсутствуют дополнительные питательные вещества для отбора плазмы.

Когда культуры будут готовы, переложите один миллилитр в микрохолодильник и гранулируйте клетки при 8 000 об/мин в течение двух минут. Затем удалите 975 микролитров надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в оставшейся надосадочной жидкости.

Затем капните по 2,5 микролитра клеточной суспензии в центр каждой лунки восьмилуночного планшета. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы рассеять клетки, и дайте им отстояться в течение пяти-10 минут. Поместите предметное стекло камеры на инвертированный флуоресцентный микроскоп, уравновешенный до 30 градусов Цельсия.

Затем используйте яркое освещение поля, чтобы найти поле клеток. Добавьте 50 микролитров предварительно подогретой среды YNB, содержащей 100 микрограммов метионина на миллилитр в 200 микролитр среды в лунке, чтобы получить конечную концентрацию метионина 20 микрограммов на миллилитр. Дайте клеткам уравновеситься в течение двух минут, прежде чем начать визуализацию.

Затем непосредственно перед получением изображения настройте микроскоп на нужную фокальную плоскость. Получение изображений GFP в ярком поле или DIC с интервалом в 5 минут в течение 45–60 минут. Использование идентичных параметров сбора данных для всех изображений в пределах временного ряда.

Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации. Количественно оцените интенсивность флуоресценции отдельных клеток в каждой временной точке и выразите значения в процентах от начальной интенсивности первого изображения. После экспорта изображений по текстовому протоколу в изображение j, откройте файлы в меню файлов с помощью опции Открыть.

Используйте флуоресцентное изображение для количественной оценки и яркое поле или изображение DIC в качестве эталона для определения местоположения клеток. Исключите мертвые клетки настоящего времени, которые кажутся темнее, чем живые клетки при просмотре с помощью ДВС-синдрома и автофлуоресценции по каналу GFP. Для изображений с неровным фоном в меню «Процесс» выберите алгоритм вычитания фона и выберите настройку по умолчанию.

После получения изображений важно выполнить фоновое вычитание, прежде чем приступать к процедуре количественной оценки. Этот шаг особенно важен, поскольку в противном случае фоновый сигнал может замаскировать или ослабить различия между образцами. Используя инструмент выделения от руки, обведите контуром ячейку, включив в нее всю ячейку, но как можно меньше области за ее пределами.

Затем в меню Анализ используйте функцию набора измерений для измерения площади, интегрированной плотности и среднего значения серого. Откройте менеджер ROI, нажав «Анализ», затем «Инструменты». В окне «Менеджер ROI» нажмите кнопку «Добавить», чтобы ввести выделенный регион в качестве нового ROI.

Повторите обводку и измерение для остальных клеток на изображении, исключив все мертвые ячейки или клетки, которые соприкасаются с краем изображения. Сохраните выбранные ROI в виде zip-файла, нажав кнопку измерения, которая отобразит измеренные значения в новом окне. Затем нажмите кнопку «Еще» и экспортируйте все измерения в электронную таблицу или программное обеспечение для статистического анализа.

Инокулировать две-три колонии дрожжевых клеток и 0,5 мл YNB среды, лишенной дополнительных питательных веществ для поддержания плазмидного отбора. Выращивайте клетки на роликовом барабане при температуре 30 градусов Цельсия в течение 16-24 часов. Добавьте один миллилитр среды YNB, которой не хватает дополнительных питательных веществ для поддержания плазмиды, и выращивайте еще три часа.

Далее переложите по одному миллилитру клеток в каждую из двух пятимиллилитровых трубок с круглым дном. Затем добавьте 0,25 мл среды YNB Met в первую пробирку и 0,25 мл среды YNB, содержащей 100 мкг метионина на миллилитр, во вторую пробирку для получения конечной концентрации 20 мкг на миллилитр. Для большого количества образцов добавьте метионин в шахматном порядке, чтобы учесть время для анализа фактов.

Наш проточный цитометр может измерять до 40 образцов за один прогон. Добавляем метионин партиями. Восемь проб каждые пять минут.

Это гарантирует, что все образцы будут измерены в период от 45 до 50 минут после добавления метионина. Инкубируйте клетки в течение 45 минут. Затем проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии, выбрав прямое рассеяние или FS в качестве меры размера клетки, и сопоставьте одну интенсивность проточной флуоресценции от фильтра FITC в качестве меры интернализации груза.

Во время 45-минутной инкубации с помощью кнопок-ползунков можно регулировать напряжение каналов FS и FITC, чтобы оптимизировать обнаружение в зависимости от диапазона размеров и интенсивности флуоресценции используемых дрожжевых клеток. Измерьте FS и интенсивность флуоресценции для 10 000 клеток из каждого условия. Используя настройку высокой скорости потока, сгенерируйте диаграмму рассеяния ФС в зависимости от интенсивности флуоресценции, щелкнув Добавить график.

Затем выберите FITC для оси x и FS для оси y и отстройте график в 1000 точек. Используя функцию гейта и условие Met дикого типа, назначьте вертикальный гейт так, чтобы примерно 5% самых ярких ячеек попадали справа от гейта. Используйте это стробирование для всех остальных условий в эксперименте.

Как показано здесь, покадровая визуализация клеток проводилась с интервалом в пять минут в отсутствие или в присутствии метионина для мониторинга интернализации Mup1 и изменений флуоресценции. Как и ожидалось, меченный GFP и фтором Mup1 оставался на плазматической мембране в отсутствие метионина. Напротив, клетки, визуализированные в присутствии метионина, показали прогрессирующее истощение флуоресцентного сигнала с поверхности клетки, что согласуется с интернализацией груза.

Тем не менее, кинетика флуоресценции, потерянная в присутствии метионина, была замедлена в клетках Mup1 GFP по сравнению с клетками pHlourin Mup1. Эти диаграммы рассеяния сравнивают интенсивность флуоресценции клеток дикого типа или четырех дельта-клеток ENTH1 в присутствии или отсутствии метионина после применения вертикального затвора. 4% Met клеток дикого типа содержались с правой стороны ворот, что соответствует самым ярким клеткам в популяции, в то время как 65% необработанных клеток дикого типа содержались в затворе.

Напротив, четыре дельта-клетки ENTH1 не показали различий в распределении ярких и тусклых клеток, что согласуется с дефектом эндоцитоза. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, если она выполнена правильно. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что время начала выполнения одновременных экспериментов должно быть распределено в шахматном порядке, чтобы данные о конечных точках могли быть собраны после одного и того же времени обработки для всех образцов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как цветочный генетический скрининг, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие новые факторы способствуют везикулярному транспорту. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области везикулярного транспорта для изучения аспектов истощения эндосом, а также недавно обнаруженного независимого от клатрина и кислотного пути в почковающихся дрожжах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать карго флорентного типа для количественной оценки эндоцитарных событий в живых клетках.