Выделение и активация мышиных лимфоцитах

Общей целью данного эксперимента является изучение функциональных возможностей очищенных лимфоцитов мышей с использованием различных функциональных анализов in vitro ad in-vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и молекулярной биологии. Например, исследование функции интересующего белка в лимфоцитах с дефицитом генов.

Основным преимуществом данной методики является возможность быстрого очищения лимфоцитов с минимальными манипуляциями и воздействием окружающей среды. Для очистки В-клеток повторно суспендируют до 10-8 раз от десяти до восьми эритроцитов в 300 микролитрах сбалансированного раствора соли или BSS с добавлением FBS. Затем добавьте 50 микролитров анти-CD43 магнитных микрошариков.

Чтобы удалить омертвевшие клетки, добавьте 30 микролитров Аннексина в пять магнитных шариков на 30 минут при четырех градусах Цельсия. Взбивайте клеточную суспензию с интервалом в 15 минут, чтобы обеспечить равномерную маркировку клеток. В конце инкубации меченные В клетки содержали 14 миллилитров BSS с добавлением FBS.

После центрифугирования удалите надосадочную жидкость, переверните пробирку и повторно суспендируйте гранулу в одном-трех миллилитрах BSS комнатной температуры, дополненной FBS. Во время центрифугирования загрузите разделительную колонну на магнитный штатив и прикрепите стерильную иглу 21 калибра к кончику колонки для уменьшения скорости потока. Уравновесьте колонну двумя миллилитрами БСС комнатной температуры.

После повторного суспендирования гранулы в одном-трех миллилитрах комнатной температуры BSS поместите сборную трубку под иглу, затем загрузите ячейки, меченные B, на уравновешенную колонку. Соберите поток через 15 миллилитров в коническую трубку. Затем промойте колонку одним миллилитром свежего BSS с добавлением FBS.

Объединив промывку с собранными целевыми ячейками, перезагрузите колонку с целевой ячейкой, содержащей алуэт, собирая поток через ту же 15-миллиметровую трубку. И трижды промыть колонку одним миллилитром БСС, дополненной ФБС, продолжая объединять промывки целевой клеточной суспензией. После третьей промывки снимите колонку с магнита и загрузите в нее пять миллилитров BSS с добавлением FBS.

С помощью колонного поршня промывка магнитно помеченных нецелевых клеток в новую 15-миллилитровую трубку. Затем проверьте чистоту отделенных клеток с помощью проточной цитометрии. Чтобы повторно использовать разделительную колонку, после промывки магнитными шариками меченых ячеек промойте колонку три раза сверху пятью миллилитрами PBS на промывку и три раза пятью миллилитрами дистиллированной воды на промывку.

Далее таким же образом промойте колонку пятью миллилитрами 70-процентного этанола и с помощью воздушного крана тщательно просушите колонку перед хранением. Чтобы повторно использовать колонку в новом эксперименте по очистке, повторно промойте колонку снизу вверх пятью миллилитрами 70-процентного этанола, а затем двумя пятимиллилитровыми промывками PBS. Затем загрузите верхнюю часть колонки пятью миллилитрами PBS для одной последней стирки.

И уравновесить колонну двумя миллилитрами БСС комнатной температуры. Затем колонка может быть загружена экспериментальной популяцией клеток. Для маркировки очищенных клеток В с помощью CFSE промойте клетки два раза свежеприготовленным раствором для мечения в конической пробирке объемом 15 миллилитров.

Повторная суспендия второй гранулы в двух случаях от 10 до седьмой клетки на миллилитр в свежем растворе для мечения 37 градусов Цельсия. Каждый раз центрифугируйте образцы, удаляйте надосадочную жидкость и переворачивайте пробирки. Затем пометьте клетки как одну часть клеточной суспензии на одну часть свежеприготовленного 10-микромольного раствора CFSE в соотношении в темноте в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Переворачивая трубку каждые две минуты, чтобы обеспечить равномерное распределение красителя. Следует соблюдать осторожность, чтобы убедиться, что клеточная гранула тщательно подвешена в растворе для маркировки. Скопления клеток могут влиять на однородность мечения CFSE.

В конце инкубации добавьте среду RPMI для гашения CFSE и промойте клетки два раза в нескольких объемах ледяной полной среды RPMI. Если ячейки были успешно помечены, гранула будет желтого цвета. Далее промойте 96 лунку плоского дна, покрытую соответствующим стимулом, два раза в PBS.

Для В-клеток, меченных CFSE, повторно суспендировать в три раза по 10 шестых В-клеток на миллилитр и заполнить среду RPMI и засеять 100 микролитров В-клеток на лунку с покрытием в трех экземплярах в течение 72 часов. С помощью этого метода истощения чистота выделенных гранул OT1-CD8 Т-клеток может быть увеличена с 72,8% до 94,2%. Затем клетки могут быть помечены CFSE как только что продемонстрированные и адаптировано переданы животным-реципиентам для анализа их пролиферации in vivo.

Кроме того, мечение антител к CD45.1 может быть использовано для дальнейшего подтверждения идентичности клеток, экспрессирующих CFSE, в качестве адоптивно перенесенных донорских CD-45.1-положительных OT1-CD8 Т-клеток в лимфоидных органах мышей-реципиентов. В качестве альтернативы, очищенные Т-клетки могут быть стимулированы in vitro, а их пролиферацию можно оценить путем включения тритидина в организм. Также с помощью этого метода достигается значительное повышение чистоты В-клеток селезенки.

Создание аналогичных возможностей для последующего функционального анализа очищенных В-клеток. После освоения этой техники ее можно выполнить за два часа. При выполнении этой процедуры важно всегда держать суспензию CI на льду, за исключением периода очистки и маркировки CFSE.

Очищенные лимфоциты также могут быть использованы в других функциональных анализах, таких как иммуноблоттинг до конечной сигнальной способности генетически модифицированных лимфоцитов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться лучшее представление о том, как очищать В- и Т-клетки и как использовать клетки для различных функциональных анализов in vitro и in vivo.