Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии
18 октября 2016 г.
Эта рукопись описывает подробный протокол для фенотипической и количественного анализа резидентных макрофагов из почек крыс с помощью проточной цитометрии. Полученные клетки могут запятнанные быть также использованы для других приложений, в том числе клеток, сортировкой анализа экспрессии генов или функциональных исследований, тем самым увеличивая информацию, полученную в экспериментальной модели.
Общая цель этой процедуры заключается в количественном определении и характеристике резидентных макрофагов из почек крыс с помощью проточной цитометрии. Этот метод может иметь ответ на ключевой вопрос о текучести, например, каков вклад каждого типа макрафага в повреждение почек. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить катетеризацию почек различных белковых маркеров. Таким образом, ограничение клеточной целостности Демонстрируя процедуру Елена Оливарес, студентка A.P.A.S.D. из Университета Комплутенсе, и Мелания Герреро, студентка A.P.A.S.D. из Для перфузии и экстракции почек, начнут с ущемления небольшой складки кожи, чтобы подтвердить, что крыса достигла соответствующего уровня седативного эффекта. И покройте глаза мазью Vet. Поместите животное на хирургический стол в положении лежа на спине. И пропитайте брюшную полость 70% этанолом. Затем сделайте центральный разрез через кожу живота и брюшины от лобка до грудной клетки, чтобы обнажить плевральную и брюшную полости. Используйте систему перфузии для введения 0,9% физиологического раствора в брюшную аорту для промывания почек. Разрезание аорты в брюшной полости для выпуска крови. Когда вся кровь будет удалена из почек, разрежьте почечную шишку. Затем надавите на край каждой почки, чтобы тщательно декапсулировать органы. А извлеченные почки переложить в свежие H.B.S.S.To получить одну почковую клеточную суспензию, с помощью ножниц разрезать половину одной почки на мелкие фрагменты. Переложите кусочки ткани в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте в пробирку 1 мл свежеприготовленной коллагеназы для 30-минутной инкубации при 37 мл
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи описывается подробный протокол фенотипического и количественного анализа резидентных макрофагов почек крысы с помощью проточной цитометрии. Полученные окрашенные клетки могут быть использованы в различных целях, что позволяет расширить объем данных, получаемых в данной экспериментальной модели.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Макрофаги играют ключевую роль в поддержании здоровья почек и развитии заболеваний почек.
- Проточная цитометрия позволяет проводить детальный анализ клеточных популяций.
- Понимание поведения макрофагов может помочь в разработке терапевтических стратегий.
- Модели на крысах часто используются для изучения функций почек.
Цель исследования
- Разработать протокол выделения и анализа макрофагов почек.
- Обеспечить возможность дальнейшего изучения функций макрофагов в контексте почечных патологий и физиологии.
- Создать ресурс для исследователей в смежных областях.
Используемые методы
- Проточная цитометрия для анализа клеток.
- Методы окрашивания для идентификации макрофагов.
- Протоколы сортировки клеток и анализа экспрессии генов.
- Функциональные исследования для оценки активности макрофагов.
Основные результаты
- Успешное выделение резидентных макрофагов из почек крысы.
- Детальная характеристика фенотипов макрофагов.
- Возможности применения в исследованиях экспрессии генов и функциональных исследованиях.
- Углубленное понимание роли макрофагов в поддержании здоровья почек.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод анализа макрофагов.
- Результаты могут быть использованы в будущих исследованиях заболеваний почек.
- Исследование может быть расширено и применено в областях, помимо проточной цитометрии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точная фенотипическая характеристика подмножеств макрофагов в моделях заболеваний почек имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в патологиях почек, вызванных воспалением. Данный протокол проточной цитометрии позволяет количественно дифференцировать провоспалительные (M1) и иммунорегуляторные (M2) фенотипы макрофагов в почках крыс, что способствует более глубокому пониманию механизмов фиброза и иммуномодуляции. Обеспечивая надежный метод оценки вклада макрофагов в повреждение почек, этот подход повышает прогностическую уверенность при выборе доклинических мишеней и изучении соответствующих сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения соотношения макрофагов M1/M2 в моделях повреждения почек.
- Практическая ценность: использование двойного гейтирования по CD45/CD68 в сочетании с окрашиванием поверхностных маркеров CD86/CD163 для высокоспецифичного определения фенотипов макрофагов.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при выборе мишеней за счет установления связи между состояниями поляризации макрофагов, фиброзом и иммунорегуляторными путями.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных проточной цитометрии по частоте макрофагов и экспрессии маркеров.
- Воспроизводимость: демонстрирует низкую клеточную смертность и сохранность целостности клеток, что позволяет получать стабильные фенотипические показатели в различных экспериментах.
- Возможности последующего использования: изолированные макрофаги остаются жизнеспособными для сортинга клеток, анализа мРНК и белков, что поддерживает проведение последующих мультиомиксных исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: метод напрямую применим к моделям воспалительных заболеваний почек, при которых патогенез определяется фенотипами макрофагов.
- Трансляционная преемственность: фенотипические данные, полученные из отсортированных макрофагов, могут быть использованы для поиска биомаркеров и функциональной валидации в доклинических исследованиях.
- Принятие решений с учетом рисков: позволяет объективно оценить влияние иммуномодулирующих соединений на поляризацию макрофагов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод встраивается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени до доклинической оценки, обеспечивая иммунологические показатели, которые используются для оптимизации ведущих соединений и изучения механизмов действия в моделях заболеваний почек.
- Открывающая биология: облегчает проверку гипотез о путях развития повреждения почек, опосредованных макрофагами, посредством количественного анализа фенотипов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные данные о макрофагах, подходящие для валидации анализа и кампаний по скринингу соединений.
- Аналитика: предоставляет многопараметрические данные проточной цитометрии (CD45+/CD68+/CD86+ для M1; CD45+/CD68+/CD163+ для M2), позволяющие проводить сравнительный анализ групп.
- Трансляционные исследования: связывают фенотипирование макрофагов с последующими функциональными тестами и профилированием экспрессии генов в системах, релевантных для данного заболевания.
- Корпоративное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс иммунофенотипирования, применимый к нескольким моделям заболеваний почек и терапевтическим областям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в процессах повреждения почек, опосредованного макрофагами, за счет обеспечения точной фенотипической дифференциации.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированное, низковариабельное выделение и окрашивание макрофагов, совместимое с оборудованием центров проточной цитометрии.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем установления связи между модуляцией мишени и измеримыми сдвигами в поляризации макрофагов.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию иммуномодулирующих кандидатов с учетом рисков на основе модуляции фенотипа макрофагов в доклинических моделях.
Рекомендации по внедрению
- Требуются экспертные знания в области компенсации при проточной цитометрии, стратегии гейтирования и валидации маркеров макрофагов.
- Зависит от наличия оборудования для переваривания коллагеназой и инфраструктуры для стерильной обработки клеток.
- Для воспроизводимого количественного определения M1/M2 необходима стандартизация панелей антител и контролей флуоресценции между различными центрами.
- Адаптация метода для других тканей может потребовать оптимизации ферментов для диссоциации и панелей маркеров.
- Ограничено доступностью специфических для крыс маркеров макрофагов (CD86, CD163) по сравнению с более обширным набором маркеров для мышей.
