Субклеточные патч-зажим Recordings от Somatodendritic домена нигральных дофамина нейронами

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как отдельные потенциал-зависимые ионные каналы влияют на функции конкретного нейрона. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет картировать функцию ионных каналов на субклеточном уровне в нейронах. Начните эту процедуру с помещения мозга на 9-сантиметровую чашку Петри с дном, покрытым слоем SiliGuard.

Далее окружите мозг ледяной сахарозой-ACSF. Чтобы приготовить корональные срезы, сделайте два надреза для удаления мозжечка и ростральной части мозга. Затем нанесите цианоакрилатный клей на лоток для образцов и приклейте мозговой блок к лотку так, чтобы ростральная часть была обращена к стадии нарезки.

Впоследствии нанесите несколько капель сахарозы-ACSF на мозг и медленно погрузите лоток в режущую камеру. После этого отрегулируйте лезвие бритвы под углом 15 градусов относительно горизонтальной плоскости. Разрежьте корональные срезы мозга размером около 500 микрометров в носовом направлении, прежде чем дойдете до черной субстанции.

Затем отрегулируйте толщину, чтобы вырезать на 300 микрометров срезы, содержащие интересующую область. Отделите срезы от тканевого блока с помощью очень тонкой иглы для обильности, прикрепленной к шприцу параллельно краю лезвия бритвы. После этого переложите ломтики в резервную камеру при температуре 34 градуса Цельсия на один час.

При этой процедуре срез мозга переносится в записывающую камеру. Закрепите срез в нижней части записывающей камеры платиновым кольцом и убедитесь, что срез хорошего качества с гладкой ровной поверхностью. Затем выберите нейрон с дендритом, простирающимся на большое расстояние в той же плоскости, и убедитесь, что интересующий дендрит может быть прослежен до четко определенной сомы.

Далее заполните патч-пипетку раствором электрода. Чтобы залатать дендрит в режиме, прикрепленном к ячейке, определите часть дендрита и сфокусируйтесь на ней. Надавите на пипетку, и опустите ее с помощью микроманипулятора.

Затем расположите пипетку близко к мембране и отрегулируйте давление, чтобы создать небольшую ямочку. Затем ослабьте давление на наконечник пипетки и заплатите дендрит, контролируя сопротивление пипетки. Постарайтесь добиться сопротивления уплотнения больше одного гигаома, в лучшем случае от трех до десяти гигаом, для записей, подключенных к ячейке.

После этого отведите пипетку от мембраны на пару микрометров, чтобы избежать деформации дендрита. Наблюдаемые здесь токи действия представляют собой потенциалы спонтанного действия нигральных нейронов. Для подавления токов действия применяют блокаторы кальциевых и натриевых каналов к ACSF.

Затем подайте шаг напряжения 90 милливольт от удерживающего потенциала в ноль милливольт, чтобы вызвать ток катионов, активированный гиперполяризацией. В конце записи разорвите патч, чтобы добиться полного режима ячейки. После этого медленно и осторожно извлеките дендритную пипетку из мембраны нейрона, чтобы получить участок наружу.

Чтобы сделать запись из соответствующей сомы в полноклеточном режиме, найдите соответствующую сому дендрита. Опустите пипетку с сопротивлением от пяти до десяти мегаом с внутриклеточным раствором на основе калия к телу клетки. Затем надавите на наконечник пипетки под кратковременным отрицательным давлением, чтобы разорвать мембрану и достичь целоклеточного режима.

Проверьте идентичность нейрона в режиме тока-зажима, применяя длинные шаги гипер- и деполяризующего тока, и позвольте биоцитину из пипетки диффундировать вдоль дендритов. Через 10 минут извлеките пипетку, чтобы получить внешний пластырь. Используйте последовательность коротких боковых движений вверх, чтобы способствовать правильному закрытию клеточной мембраны, как только пипетка окажется над срезом, чтобы полностью выйти из записывающей камеры.

Подержите срез в записывающей камере еще 15 минут в стандартном ACSF, чтобы обеспечить равновесие биоцитина и регистрируемого нейрона. Затем аккуратно переложите срез в флакон из янтарного стекла объемом 25 миллилитров, содержащий стандартный ACSF для гистологии. В этой процедуре грубо расположите флуоресцентно помеченный нейрон в срезе с эпифлуоресценцией.

Кратко изучите дендритную оболочку нейронов и найдите аксон и аксональный пузырь с помощью объектива 10X. Далее переключитесь на конфокальный микроскоп и выберите лазерный диод на 488 нанометров, чтобы возбудить меченный нейрон. Проследите за продолжением аксона и дендритов по оси Z и запишите последовательные изображения, чтобы получить стек Z для всей ячейки.

Отрегулируйте разрешение по оси Z и соберите конфокальные изображения клетки с низким и большим увеличением. В конце откройте файл изображения нейрона с помощью программного обеспечения для визуализации. Сравните проекционное изображение Z с изображением IR-DGC на глаз, чтобы определить точное положение патч-пипетки во время электрофизиологической записи.

Здесь показано изображение дофаминового нейрона в формате IR-DGC и пипетки на проксимальном дендрите. Кривая тока показывает емкость токов утечки EN в ответ на команду напряжения в пять милливольт, в конфигурации, подключенной к ячейке, с сопротивлением уплотнения пять гигаОм. Шаг гиперполяризующего напряжения от мембранного потенциала в ноль милливольт индуцировал медленно активируемый гиперполяризационный катионный ток.

Кривая тока была инвертирована и снабжена одной экспоненциальной функцией, что дало постоянную времени в 632 миллисекунды. Вот реакция напряжения всей клетки, записанная сома на односекундные импульсы гипер- и деполяризующего тока в присутствии блокаторов напряжения натрия и кальция тока для снятия потенциалов действия во время записи прикрепленной клетки. Однажды освоив эту технику, ее можно сделать за один день, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что необходимо получить здоровые ткани и стабильные условия для записи. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как идентичность зарегистрированного нейрона. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейрофизиологии к изучению функции свойств и роли потенциал-зависимых ионных каналов в возбудимых клетках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как записывать и изучать распределение токов, протекающих по потенциал-зависимым ионным каналам в дендритах.