Использование капиллярный электрофорез для Количественно органических кислот из растительных тканей: Случай испытания экспертизы

Общая цель данной процедуры заключается в количественном определении уровней органических кислот в растительных тканях. Этот метод может быть использован для решения вопросов биохимии и физиологии растений, таких как влияние факторов окружающей среды на рост корней, развитие сельскохозяйственных культур, а также качество пищевых продуктов или напитков. Основными преимуществами данного метода являются минимальная подготовка образцов, высокая пропускная способность, а также большая экономическая эффективность капиллярного электрофореза по сравнению с масс-спектрометрией.

Хотя этот метод используется для выяснения физиологических реакций растений, он также может быть применен в пищевой науке и контроле качества пищевых продуктов, где органические кислоты оказывают критическое влияние на вкус, безопасность и стабильность. Для начала подготовьте образцы для экстракции короткоцепочечных карбоновых кислот (SCCA). Подготавливайте по одному грамму кофейных зерен за раз, чтобы после обработки осталось достаточное количество образца.

Для достижения однородного размера частиц и максимальной эффективности экстракции SCCA предварительно охладите ступку и пестик жидким азотом. Поместите образец в небольшое количество жидкого азота в ступке. С помощью ковша добавьте в ступку достаточное количество жидкого азота, чтобы образец был полностью погружен.

Поместите трудноизмельчаемые образцы, такие как сырые кофейные зерна, в жидкий азот. Перед измельчением дайте им замерзнуть в течение 10–30 секунд. Разбейте ткань на более мелкие фрагменты с помощью вертикальных раздавливающих движений.

Затем полностью измельчите ткань круговыми движениями. Повторите этапы замораживания и измельчения еще дважды, чтобы образцы были измельчены в общей сложности три раза. Как правило, три последовательных цикла измельчения позволяют довести образцы до состояния порошка с консистенцией муки.

Перенесите порошок в стеклянные флаконы или микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 ml. Приступите к последующей обработке сразу после измельчения или храните образцы при 80 °C до момента их экстракции. Подготовьте подлинные стандарты соответствующих SCCA для создания внешних и внутренних стандартных растворов, которые будут использоваться для определения концентрации SCCA.

Для образцов кофе в качестве целевых кислот используйте лимонную, яблочную, уксусную и молочную кислоты, а в качестве внутреннего стандарта — адипиновую кислоту. Приготовьте основной раствор с концентрацией 10 мг/мл, добавив 100 мг стандарта в мерную колбу объемом 10 мл. Доведите объем раствора в мерной колбе до метки 10 мл, используя сверхчистую воду, для растворения кислоты.

Перенесите каждый исходный раствор в чистую 15-миллилитровую стеклянную пробирку с крышкой, выстланной политетрафторэтиленом, и герметично закройте парафиновой пленкой. Исходные растворы можно хранить в герметичных пробирках при температуре 4 °C в течение одной недели. Приготовьте 50 мл экстракционного раствора SCCA, разбавив исходный раствор внутреннего стандарта в ультрачистой воде до концентрации 0,05 мг/мл.

Для этого добавьте 250 µL основного раствора внутреннего стандарта к 49,75 mL воды. Затем подготовьте образцы для калибровочной кривой интересующих вас SCCA. Используйте как минимум пять точек с концентрациями в диапазоне линейного отклика, которые охватывают ожидаемые концентрации SCCA в образцах.

Разбавьте каждую пробу SCCA до определенной концентрации в новых микроцентрифужных пробирках, используя ультрачистую воду до объема одного миллилитра. Убедитесь, что каждая точка концентрации содержит все четыре стандарта кислот и внутренний стандарт в правильной концентрации. Извлеките образцы, предназначенные для экстракции, из условий хранения и поместите их на лед.

Взвесьте 100 миллиграммов образца для экстракции SCCA. Отмерьте количество образца, максимально близкое к целевой массе, чтобы снизить вариабельность. После взвешивания каждого образца перенесите ткань в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Отслеживайте массу каждого измеренного образца, так как количество определяемых SCCAs будет нормализовано с использованием массы образца. После взвешивания всех образцов добавьте один миллилитр экстракционного раствора в каждую из пробирок с образцами. Поддерживайте одинаковое соотношение экстракционного раствора к массе ткани для всех экстракций.

Тщательно перемешайте образцы с помощью вортекса в течение 10 секунд. Оставьте образцы при комнатной температуре на один час. В течение этого часа каждые 15 минут перемешивайте содержимое каждой пробирки на вортексе в течение 10 секунд.

После одного часа экстракции в последний раз перемешайте образцы и перенесите пробирки в микроцентрифугу. Центрифугируйте образцы при температуре 4 °C с ускорением 10 000 ×g в течение 10 минут для осаждения твердого материала. Для фильтрации образцов подготовьте дисковые фильтры, установленные на шприцы, убедившись, что каждый фильтр правильно закреплен на шприце.

Подготовьте по одному шприцу с дисковым фильтром для каждого анализируемого образца, включая образцы для построения стандартной кривой. Фильтруйте супернатанты непосредственно в чистую микроцентрифужную пробирку. После фильтрации закройте пробирку с фильтратом и утилизируйте шприцевой фильтр.

Перенесите один миллилитр образца в каждую пробирку для капиллярного электрофореза (КЭ), стараясь не допустить попадания образца на горлышко пробирки. После переноса образца закройте каждую пробирку колпачком для КЭ. Настройте запуск детектирования SCCA согласно текстовому протоколу.

Поместите во входной лоток для образцов флаконы с точками стандартной кривой и флаконы с образцами для анализа, следуя инструкциям производителя. Отметьте положение каждого флакона для программирования автосамплера. После кондиционирования, описанного в текстовом протоколе, запустите разделение образцов, открыв меню Control в программном обеспечении и выбрав Run Sequence.

Следите за массивом фотодиодов или лотками PDA, чтобы обеспечить надлежащее разделение. Проверьте первый след и убедитесь, что он имеет плоскую базовую линию и четко разделяет отдельные пики кислот. Для интегрирования пиков образцов откройте первый файл и настройте шаги автоматического интегрирования так, чтобы исключить первые три минуты анализа.

В этом же меню установите критерии выбора пика: минимальную ширину пика — 50 единиц, площадь пика — 100 единиц, чтобы обеспечить умеренно высокий уровень селективности, отделяя кислотные пики от фонового шума на хроматограмме. Выполните анализ данных, как описано в текстовом протоколе. Здесь представлено сравнение хроматограмм ПДА, на которых выделен перегруженный образец.

При увеличении концентрации аналита геометрия отдельных пиков может стать асимметричной. При концентрации 0,05 мг/мл уксусная кислота дает четко выраженный билатерально-симметричный пик. По мере увеличения концентрации уксусной кислоты до 0,07 или 0,10 мг/мл пик становится асимметричным и начинает формироваться «хвост» пика.

Такой хвост пика является явным признаком перегрузки образца. Здесь представлены примеры трейсов PDA, демонстрирующие содержание органических кислот в образцах зеленого кофе. Образцы зеленого кофе были разбавлены в соотношении 1:10 перед загрузкой в виалы для КЭ.

К интересующим кислотам относятся уксусная, лимонная, молочная, яблочная кислоты, а также внутренний стандарт — адипиновая кислота. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости измельчения образцов до однородного состояния и тщательного дозирования проб с помощью пипетки для максимального повышения воспроизводимости и минимизации экспериментальной ошибки. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как количественно определять органические кислоты в образцах растений с помощью капиллярного электрофореза (КЭ). Вы сможете самостоятельно измельчать образцы растений, экстрагировать органические кислоты и подготавливать растительные экстракты для последующего анализа методом КЭ.