Методологии для изучения B. Сенная биопленки в качестве модели для Характеризуя Molecule биопленки Small ИНГИБИТОРЫ

Бактериальные биопленки важны для здоровья человека, защищая их бактериальных обитателей от вредного воздействия окружающей среды и антимикробных агентов. Целью данной процедуры была разработка модельной системы для оценки влияния низкомолекулярных ингибиторов на образование биопленки. Эти методы могут помочь создать набор инструментов, необходимых для биопленки для выбора низкомолекулярных ингибиторов, которые специально нацелены на образование биопленки.

Основное преимущество этих методологий заключается в том, что они исходят из последовательной, надежной экспериментальной основы и дают количественное и качественное представление о механизме действия биопленочных ингибиторов. Хотя эти методы могут дать представление о биопленках Bacillus subtilis, они также могут быть применены к другим бактериям, образующим биопленку, таким как Pseudomonas aeruginosa или патоген растений Xanthomonas citri. Сканирующая электронная микроскопия может иметь важное значение для анализа влияния малых молекул на образование биопленки, поскольку она позволяет наблюдать за внеклеточным матриксом и дает разрешение для одной клетки.

Для начала сначала выберите подходящую одиночную колонию, и переложите в нее три миллилитра бульона LB. Поместите эту закваску в встряхивающий инкубатор на четыре часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации берут 1,5 миллилитра закваски, и центрифугируют в течение четырех минут.

Осторожно удалите надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте гранулу в 1,5 миллилитрах среды MSgg. Чтобы вырастить пленку, приготовьте 12-луночный планшет для клеточной культуры, добавив в каждую лунку по три миллилитра MSgg. В некоторые из этих лунок добавьте MSgg с ингибитором малых молекул в диапазоне концентраций, распределяя расположение различных концентраций вокруг чашки, чтобы избежать краевых эффектов.

Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах повторно суспендированной закваски. Культура должна быть от 0,6 до единицы. Это имеет решающее значение для надежности системы.

Окультурьте каждую лунку культуральной пластины 3 микролитрами повторно суспендированной закваски. Затем инкубируйте планшет при температуре 23 градуса Цельсия в течение трех дней в статических условиях. После этого достаньте тарелку из инкубатора, и понаблюдайте за пленками.

Чтобы вырастить биопленки, используйте шаблон и симметрично нанесите четыре отдельные капли по 1,5 микролитра немытой закваски на 8,5-сантиметровую высушенную пластину 1,5% Agar MSgg. Дайте каплям впитаться в среду перед перемещением пластины. Выдерживайте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех дней.

С помощью бинокля с равномерным экспозицией освещения проверьте, что колонии биопленки развились и образовали трехмерную морщинистую структуру. Для начала возьмите чистое лезвие бритвы и разрежьте колонии биопленки на две равные части с помощью шаблона. Осторожно приподнимите одну половину колонии чистым шпателем и переложите ее в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра, содержащую 500 микролитров PBS.

Возьмите вторую половину колонии и переложите ее в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 микролитров 50% этанола. Они будут использоваться для оценки устойчивости к стерилизующим агентам. После этого аналогичным образом возьмите первую половину колонии, обработанной D-лизином, и поместите ее в PBS.

Затем возьмите вторую половину этой колонии, и переведите ее на этанол. Инкубируйте все пробирки, содержащие половинки биопленки, в течение 10 минут при комнатной температуре. А затем центрифугируйте их в течение пяти минут при 18 000 раз изб.

С помощью пипетки осторожно удалите надосадочную жидкость. Добавьте 300 микролитров PBS, а затем обработайте клетки ультразвуком на низкой температуре с помощью ультразвукового аппарата с микронаконечником. Добавьте еще 700 микролитров PBS для получения конечного объема в один миллилитр.

Затем выполните последовательное разведение 10 до отрицательных семи в PBS. Возьмите 100 микролитров одного из разведений и закиньте пластину с 1,5%-ным агаром LB. Повторите этот шаг для двух других разведений на образец.

Разложите иннокулюм с помощью стеклянных бусин, а затем инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия. Осмотрите планшеты и подсчитайте колониеобразующие единицы, или КОЕ. После расчета КОЕ на миллилитр рассчитайте процент выживших при обработке PBS по сравнению с обработкой этанолом.

Чтобы начать фиксацию образца, сначала приготовьте достаточное количество свежего фиксирующего раствора для нужного количества колоний биопленки. Осторожно добавьте пять миллилитров фиксатора в каждую чашку Петри и избегайте пипетирования непосредственно на колонии. Колонии начнут отделяться от агара и плавать.

Тщательно запечатайте пластины парапленкой, и выдержите на ротационном шейкере в течение двух часов при комнатной температуре. Перенесите пластины на хранение при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Аккуратно удалите фиксирующую жидкость с помощью пастеровской пипетки, подключенной к вакууму.

Добавьте 10 миллилитров 100 наномолярного какодилата натрия, пять миллимолярных буферов хлорида кальция, чтобы промыть биопленку, и инкубируйте в течение пяти минут. Осторожно отсоедините центр колонии биопленки от агаровой пластины с помощью пастеровской пипетки. Чтобы высушить колонии на воздухе, разрежьте целлюлозную фильтровальную бумагу на четвертинки, а затем погрузите одну секцию в 100% этанол.

Осторожно перенесите одну плавающую колонию биопленки на бумагу. Поместите бумагу в чашку Петри, застеленную сухой фильтровальной бумагой. Затем накройте посуду крышкой, и оставьте ее в химической вытяжке для просушки на ночь.

Чтобы сохранить морфологию колонии биопленки, важно полностью покрыть плавающую биопленку целлюлозной бумагой. Оказавшись на бумаге, биопленка не может быть отрегулирована повторно. Покройте огрызок электронной микроскопии углеродной лентой, а затем с помощью пинцета аккуратно перенесите колонии биопленки на огрызок.

После подключения каждой колонии к заглушке, добавив тонкий мостик из углеродной ленты, храните заглушки в эксикаторе в течение 24 часов или до тех пор, пока они не понадобятся. Этот шаг требует твердой и точной руки, потому что на этом этапе биопленки очень хрупкие и легко ломаются. Задача состоит в том, чтобы смонтировать значительную часть биопленки без трещин.

В день осмотра поместите колонии в установку для нанесения золото-палладиевого напыления. Покройте образцы в течение двух минут под углом 60 градусов. Повторите этот шаг дважды, поворачивая образцы на 120 градусов между ними.

Наконец, обмажьте образцы один раз в течение трех минут сверху. Теперь образцы готовы к визуализации на СЭМ. На этих изображениях показано пелликальное образование B.subtilis, выращенного в среде MSgg, индуцирующей биопленку.

С добавлением низкомолекулярного ингибитора D-лизина развитие пленки снижается. И по мере увеличения концентрации ингибитора образование пленки демонстрирует коррелирующее снижение. На этом графике показано влияние воздействия этанола на выживаемость клеток в колониях биопленки, обработанных ингибитором D-лизина или оставленных без лечения.

Колонии, получавшие D-лизин и подвергавшиеся воздействию 50% этанола в течение 10 минут, показали резкое снижение выживаемости по сравнению с необработанной фракцией. Бинокулярные изображения сверху вниз показывают, что колонии, выращенные в присутствии D-лизина, были меньше в целом и образовывали менее выраженные морщины, чем те, которые не лечились. Изображения высушенных биопленок в критических точках с помощью сканирующего электронного микроскопа еще больше раскрывают измененное развитие биопленки.

Матрица внеклеточных полимерных веществ, или EPS, больше похожа на паутину в необработанных образцах, при этом обработанные образцы демонстрируют меньшую организацию. Наконец, исследование на разрешение отдельных бактериальных клеток показывает, что обработанные клетки имеют удлиненный внешний вид, менее покрыты ЭПС и не так тесно связаны со своими соседями, как необработанные клетки. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что создание последовательной основы для изучения ингибиторов биопленки имеет важное значение для воспроизводимых результатов.

После освоения скрининг малых молекул на ингибирование биопленки может быть проведен менее чем за неделю, если он выполнен правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как исследование экспрессии генов в одиночных биопленочных клетках, чтобы получить дополнительное представление о мишени низкомолекулярного ингибитора. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать общее влияние специфических ингибиторов биопленки на развитие биопленки и устойчивость к антибиотикам.