Определение субстрата специфичностью для липазы и фосфолипазы кандидатов

Общая цель данной процедуры заключается в ускорении обнаружения физиологических субстратов для потенциальных липаз и фосфолипаз. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области энтомологии, например, о том, как фосфолипазы способствуют ремоделированию липидов в биологических мембранах. Главным преимуществом данного метода является то, что оптимизация ферментативной активности и поиск природного субстрата для фермента могут проводиться независимо друг от друга.

Хотя этот метод позволяет получить представление о субстратной специфичности бактериальных липаз и фосфолипаз, его также можно модифицировать для изучения гидролаз любых других модельных организмов. Впервые идея этого метода возникла у нас при поиске ферментативной активности, способной расщеплять собственный мембранный липид фосфатидилхолин у rhizobium meliloti. Для подготовки белковых экстрактов из клеток разморозьте суспензии бактериальных клеток и храните их на льду.

Затем трижды пропустите клеточные суспензии через холодную камеру высокого давления при 20, 000 pounds per square inch. Удалите неповрежденные клетки и клеточный дебрис путем центрифугирования при 5, 000 ×g в течение 30 минут при температуре four degrees Celsius. После центрифугирования prepare аликвоты по 100 и 500 µL из супернатанта для последующего анализа.

Подготовьте ранее оптимизированный ферментативный анализ, используя схемы пипетирования, представленные в текстовом протоколе. Для первоначального охвата различных типов ферментативной активности используйте искусственные субстраты, которые при гидролизе дают окрашенный продукт, такие как пара-нитрофенол или производные PNP. В спектрофотометре при температуре 30 °C в течение пяти минут отслеживайте кинетику увеличения абсорбции при 405 нм, обусловленную образованием PNP.

Наконец, выполните расчеты, описанные в текстовом протоколе. Для радиоактивного мечения липидов подготовьте ночную предкультуру интересующего организма в пяти миллилитрах подходящей питательной среды и инкубируйте при 30 °C. Из предкультуры проведите инокуляцию в 20 мл свежей среды в культуральную колбу объемом 100 мл, чтобы получить начальную оптическую плотность культуры при 620 нм, равную 0,3.

Затем в стерильных условиях перенесите аликвоту культуры объемом 1 мл в стерильную полистирольную пробирку с круглым дном объемом 14 мл. Добавьте 1 мкКи 114 c ацетата в 1 мл культуры. После этого инкубируйте жидкую культуру при перемешивании при 30 °C в течение 24 часов.

По окончании периода инкубации перенесите культуру в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл и центрифугируйте при 12 000 ×g при комнатной температуре в течение пяти минут. Ресуспендируйте осадок в 100 µL воды. На данном этапе суспензию клеток следует хранить при температуре -20 °C или сразу приступить к экстракции полярных липидов.

Для экстракции полярных липидов добавьте 375 µL раствора метанола в хлороформе в соотношении два к одному к 100 µL водной суспензии клеток. Перемешайте образец на вортексе в течение 30 секунд, затем инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации центрифугируйте в течение пяти минут при 12 000 ×g при комнатной температуре.

Затем перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Далее добавьте к супернатанту 125 µL хлороформа и 125 µL воды. После перемешивания в вортексе в течение 30 секунд центрифугируйте образец в течение одной минуты при 12 000 ×g при комнатной температуре.

Перенесите нижнюю хлороформную фазу в новую пробирку. Затем высушите раствор струей газообразного азота. Растворите высушенные липиды в 100 µL раствора хлороформа в метаноле.

Для разделения нейтральных полярных липидов методом тонкослойной хроматографии нанесите аликвоты проб липидов объемом 3 µL на алюминиевую пластину с высокоэффективным слоем силикагеля, начиная с отступа в 2 см от краев пластины. При анализе нескольких проб в одномерной хроматографии соблюдайте расстояние не менее 1,5 см между точками нанесения различных образцов. Перенесите подвижную фазу в камеру для развития ТСХ, стенки которой изнутри обклеены хроматографической бумагой.

Накройте стеклянной пластиной, чтобы камера насытилась в течение 30 минут. Поместите в камеру алюминиевую пластину HPTLC Silica Gel с высушенными образцами липидов. Оставьте пластину для разделения на 30 минут в закрытой камере, после чего извлеките её.

Затем дайте растворителям испариться в ламинарном шкафу в течение двух часов. После высыхания пластинки ТСХ с разделенными компонентами инкубируйте ее с фотостимулируемым люминесцентным экраном в закрытой кассете в течение трех дней. Затем подвергните инкубированный экран сканированию на PSL-сканере и получите виртуальное изображение разделенных радиоактивно меченных липидов.

Для определения активности диацилглицероллипазы (DAG-липазы) сначала добавьте 5 000 CPM 14 C-меченого DAG в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Также добавьте в пробирку раствор Triton X-100 и перемешайте с помощью вортекса. Высушите раствор в потоке азота.

Для получения конечного объема анализа 100 µL добавьте буфер Tris-HCl, раствор NaCl и бидистиллированную воду. Перемешайте на вортексе в течение пяти секунд. Запустите реакцию, добавив в раствор 5 µL фермента.

Инкубируйте раствор при 30 °C в течение четырех часов. Остановите реакцию, добавив 250 µL метанола и 125 µL хлороформа, после чего экстрагируйте липиды, как было описано ранее в этом видео. Перейдите к анализу нейтральных полярных липидов с помощью 1DTLC и последующей PSL-визуализации, как делали ранее.

Хотя предсказанная фосфолипаза SMc01003 проявляет активность в отношении искусственных пара-нитрофенольных ацилзамещенных эфиров, эта активность лишь в два или три раза превышает фоновую активность в бесклеточных экстрактах Escherichia coli, в которых не экспрессировались чужеродные гены. Это указывает на то, что пара-нитрофенильные ацилзамещенные эфиры, по-видимому, не являются подходящими субстратами для SMc01003. В то время как бесклеточные экстракты E. coli не способны расщеплять диацилглицерин, экстракты штаммов, в которых была экспрессирована предсказанная фосфолипаза SMc01003, вызывали деградацию диацилглицерина.

Хотя предполагалось, что SMc01003 является фосфолипазой, на самом деле это диацилглицероллипаза, которая расщепляет диацилглицерол до моноацилглицерола и одной жирной кислоты. Затем она подвергает дальнейшему расщеплению моноацилглицерол до глицерина и другой жирной кислоты. После освоения эта методика может быть выполнена за несколько недель при условии правильного проведения процедуры.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оптимизировать ферментативную активность липаз и фосфолипаз, а также о том, как продолжить поиск их физиологических субстратов. Важным преимуществом данной процедуры является возможность разделить процесс оптимизации активности фермента и поиск его природного субстрата. Не забывайте, что работа с органическими растворителями или радиоактивными веществами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать необходимые меры предосторожности.