Определение субстрата специфичностью для липазы и фосфолипазы кандидатов

Общая цель этой процедуры заключается в ускорении обнаружения физиологических субстратов для потенциальных липаз и фософолипаз. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области энтомологии, например, как фосфолипазы способствуют ремоделированию липидов в биологических мембранах. Основное преимущество данной методики заключается в том, что оптимизация ферментативной активности и поиск естественного субстрата для фермента могут быть выполнены независимо друг от друга.

Хотя этот метод может дать представление о субстратной специфичности бактериальных липаз и фосфолипаз, он также может быть модифицирован для изучения гидролаз любых других модельных организмов. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы искали ферментную активность, которая могла бы разрушать липид внутренней мембраны фосфатидилхолин inorhizobium meliloti. Чтобы приготовить бесклеточные белковые экстракты, размораживайте бактериальные клеточные суспензии и храните их на льду.

Затем трижды пропустите суспензии ячеек через ячейку холодного давления со скоростью 20 000 фунтов на квадратный дюйм. Удалите неповрежденные клетки и клеточный мусор центрифугированием при 5000 раз g в течение 30 минут, при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования приготовьте аликвоты объемом 100 и 500 микролитров из надосадочной жидкости для последующего анализа.

Настройте ранее оптимизированный ферментный анализ, используя схемы пипетирования, таблицы которых приведены в текстовом протоколе. Для первоначального охвата различных ферментативных активностей используйте искусственные субстраты, которые при гидролизе дают окрашенный продукт, такой как производные паранитрофенола или PNP. Следите за ходом времени для увеличения поглощения на 405 нанометрах за счет формирования PNP в спектрофотометре при 30 градусах Цельсия в течение пятиминутного периода.

Наконец, выполните вычисления, как описано в текстовом протоколе. Для радиомечения липидов готовят ночную предварительную культуру интересующего организма в пяти миллилитрах нужной питательной среды и выращивают при 30 градусах Цельсия. Из предкультуры инокулируют в 20 миллиметров свежей среды в 100-миллиметровую колбу для культуры, чтобы получить начальную оптическую плотность на 620 нанометрах 0,3 для культуры.

Далее переложите одномиллилитровую аликвоту культуры в 14-миллилитровую стерильную полистирольную трубку с круглым дном в стерильных условиях. Добавьте одну микрокюри 114 c ацетата к одномиллилитровой культуре. Затем инкубируйте жидкую культуру при перемешивании при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов.

В конце инкубационного периода переложите культуру в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров и центрифугируйте при 12 000 г при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах воды. На этом этапе храните клеточную суспензию при температуре минус 20 градусов Цельсия или немедленно продолжайте экстракцию полярных липидов.

Чтобы выполнить экстракцию полярных липидов, добавьте 375 микролитров раствора метанола два к одному к хлороформу на 100 микролитров водной клеточной суспензии. Ввергните образец в вихревой поток в течение 30 секунд перед инкубацией в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации центрифугируйте в течение пяти минут при 12 000 раз g при комнатной температуре.

Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Далее добавьте в надосадочную жидкость 125 микролитров хлороформа и 125 микролитров воды. После вортексирования в течение 30 секунд центрифугируйте образец в течение одной минуты при 12 000 умноженных на g при комнатной температуре.

Перенесите нижнюю хлороформную фазу в свежую пробирку. Затем высушите раствор струей газообразного азота. Растворите высушенные липиды в 100 микролитрах хлороформа до раствора метанола.

Для выделения нейтральных полярных липидов методом тонкослойной хроматографии нанесите три микролитра аликвот липидных образцов на высокопроизводительный тонкослойный хроматографический силикагелевый алюминиевый лист, начиная с двух сантиметров от краев пластины. Если с помощью одномерной хроматографии анализируется несколько образцов, соблюдайте дистанцию не менее 1,5 сантиметра между различными местами нанесения образца. Перенесите подвижную фазу в проявочную камеру TLC, покрытую изнутри хроматографической бумагой.

Накройте стеклянной тарелкой, чтобы дать камере пропитаться в течение 30 минут. Перенесите алюминиевый лист силикагеля HPTLC с высушенными образцами липидов в камеру. Дайте пластине проявиться в течение 30 минут в закрытой камере, прежде чем снимать пластину.

Затем дайте растворителям высохнуть в проточном колпаке в течение двух часов. Как только проявленный лист TLC высохнет, инкубируйте его с фотостатизируемым люминесцентным экраном в закрытой кассете в течение трех дней. Затем подвергните инкубированный экран воздействию сканера PSL и получите виртуальное изображение отделенных липидов, меченных радиоактивными метками.

Чтобы определить активность липазы диацилглицерина, или DAG, сначала добавьте 5000 CPM 14 DAG, меченных C, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Также добавьте в тюбик раствор Triton X-100 и перемешайте вихрем. Высушите раствор под струей азота.

Для окончательного анализа объемом 100 микролитров добавьте буфер Tris-HCl, раствор хлорида натрия и бидистиллированную воду. Вихрь в течение пяти секунд. Инициируйте реакцию, добавив в раствор пять микролитров фермента.

Инкубируйте раствор при температуре 30 градусов Цельсия в течение четырех часов. Остановите реакцию добавлением 250 микролитров метанола и 125 микролитров хлороформа, перед тем как извлечь липиды, как описано ранее в этом видео. Перейдите к анализу нейтральных полярных липидов с помощью 1DTLC и последующей PSL-визуализации, как и раньше.

Несмотря на то, что предсказанная фософолипаза SMc01003 проявляет активность с искусственными ациловыми эфирами пара-нитрофенола, эта активность лишь в два или три раза превышает фоновую активность, присутствующую в бесклеточных экстрактах кишечной палочки, в которых чужеродный ген не экспрессировался. Это указывает на то, что паранитрофенилакриловые эфиры, по-видимому, не являются хорошими субстратами для SMc01003. В то время как бесклеточные экстракты E.Coli не могут разлагать диацилглицерин, экстракты штаммов, в которых экспрессировалась предсказанная фосфолипаза SMc01003, вызывали деградацию диацилглицерина.

Хотя было предсказано, что SMc01003 является фосфолипазой, на самом деле это диацилглицероллипаза, которая разлагает диацилглицерин до моноацилглицерина и одной жирной кислоты. Затем он разлагает моноацилглицерин до глицерина и другой жирной кислоты. После освоения этой техники ее можно сделать за несколько недель, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оптимизировать ферментативную активность липаз и фосфолипаз, и как продолжить поиск их физиологических субстратов. Важнейшим преимуществом этой процедуры является то, что оптимизацию активности фермента можно отделить от поиска естественного ферментного субстрата. Не забывайте, что работа с органическими растворителями или радиоактивными веществами может быть чрезвычайно опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать необходимые меры предосторожности.