В Vivo Изучение человеческого взаимодействия Эндотелиальная-перицитов Использование гелевой матрицы штепсельной вилки пробирного мыши

Общая цель данного анализа в матригеле in-vivo заключается в исследовании взаимодействия эндотелиальных клеток с паразитами. Этот анализ в матригеле разработан, чтобы помочь исследователям изучить основные этапы ангиогенеза. Он также позволит идентифицировать сигнальные пути, ответственные за основные этапы формирования кровеносных сосудов, а также гены, дисфункция которых может привести к сосудистым расстройствам и другим аномалиям ангиогенеза.

Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет изучать формирование кровеносных сосудов in-vivo с участием как эндотелиальных клеток, так и поддерживающих их клеток — перицитов. Для начала вырастите культуры эндотелиальных клеток человека и перицитов на 100-миллиметровых планшетах с 10 мл соответствующей среды. Заменяйте среду каждые два-три дня, пока клетки не достигнут 80% конфлюэнтности.

Для подготовки раствора матрикс-геля для смешивания с клетками разморозьте имеющийся запас матрикс-геля в течение ночи при температуре 4 °C. Затем разлейте его по аликвотам объемом 1,5 мл для длительного хранения при -20 °C или при 4 °C на срок до двух недель. Для каждого экспериментального плага потребуется 200 µL матрикс-геля.

Таким образом, одна пробирка из имеющихся запасов может обеспечить шесть проб с 25%-ным избытком. Подготовьте каждую необходимую аликвоту для использования, добавив 15 µL размороженного 100x стокового раствора beta-FGF. Перемешайте beta-FGF в растворе с помощью пипетирования, затем инкубируйте на льду не менее 30 минут перед добавлением клеток.

На данном этапе охладите несколько инсулиновых шприцев объемом 1 мл с иглой 28G для проведения инъекций. Чтобы собрать клетки с культуральных планшетов, удалите среду и один раз промойте клетки раствором PBS. После удаления PBS добавьте один миллилитр раствора трипсина и верните планшеты в инкубатор на одну минуту.

Затем пипеткой нанесите 2 мл культуральной среды на планшеты для открепления клеток и соберите среду в пробирку объемом 15 мл. Затем проверьте концентрацию собранных клеток с помощью гемоцитометра. После этого подготовьте аликвоты клеток в пробирках объемом 15 мл.

Для экспериментальной группы здесь используется комбинация из одного миллиона эндотелиальных клеток и 200 000 паразитов. Далее центрифугируйте аликвоты клеток при 400g в течение пяти минут. Затем добавьте рассчитанный объем матригеля к клеточному осадку и аккуратно перемешайте пипетированием, чтобы не образовалась пена, так как пузырьки воздуха не должны попасть в образец при введении.

Теперь держите препараты на льду до момента начала инъекций мышам. После наркотизирования мыши изофлураном и подтверждения состояния наркоза с помощью щипкового теста пальца ноги закрепите мышь в нерециркуляционной системе подачи изофлурана и поместите её на грелку брюшной стороной вниз. Затем удалите шерсть с площади примерно одного квадратного сантиметра в обеих латеральных областях задних конечностей.

Затем очистите открытый участок кожи, протерев его 70% alcohol. Далее наберите один миллилитр подготовленного раствора клеток в охлажденный шприц, чего достаточно для четырех пробок. Чтобы выполнить инъекцию, приподнимите кожу спины, чтобы найти подкожное пространство.

Затем медленно и равномерно введите 200 µL в подкожное пространство позади грудной клетки, после чего медленно извлеките иглу, чтобы предотвратить вытекание препарата. После инъекции в месте введения образуется припухлость. Протрите это место спиртом, затем обведите припухлость перманентным маркером, чтобы ее можно было легко найти позже.

Затем повторите процедуру инъекции с другой стороны мыши. Обязательно введите все клетки в течение трех минут, иначе они начнут прилипать к шприцу. Этап инъекции имеет решающее значение для обеспечения формирования пробки из матриксного геля между слоями кожи и мышц, чтобы пробка сохраняла правильную форму и не становилась диффузной.

Прежде чем переходить к инъекции следующей мыши, оставьте введенную мышь на грелке на одну минуту, чтобы матрикс успел гелеобразно затвердеть. После эвтаназии поместите мышь на операционный стол. После удаления всех вновь выросших волосков в месте инъекции найдите маркерные линии, определяющие положение имплантата.

Затем с помощью тонких хирургических ножниц сделайте надрез вдоль отмеченной границы пласта, перпендикулярно коже и до самой подлежащей мышцы. Осторожно вырежьте по периферии отмеченной границы. Затем извлеките пласт, удерживая его между слоями кожи и мышц.

Сразу же промойте пробку в небольшом стакане с PBS, чтобы удалить кровь. Затем поместите всю пробку в пробирку объемом 50 миллилитров с 25 миллилитрами 4% параформальдегида. Оставьте для фиксации при комнатной температуре на 24 часа без перемешивания.

На следующий день перенесите эксплантаты в 25 миллилитров 70% этанола на 24 часа. Затем приступайте к заливке в парафин. Срезы эксплантатов, содержащие только эндотелиальные клетки, показывают, что некоторые сосуды не перфузируются кровью реципиента после 14 дней in-vivo.

Напротив, пробки, содержащие как эндотелиальные клетки, так и паразитов, демонстрируют наличие множества перфузируемых сосудов через 14 дней in-vivo. В этих пробках обнаруживаются клетки, положительные по окрашиванию на актин гладких мышц (отображены красным), расположенные непосредственно рядом с CD31-положительными эндотелиальными клетками (отображены зеленым). Таким образом, паразиты могут играть существенную роль в формировании новых кровеносных сосудов.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как применять этот эффективный метод in-vivo для изучения формирования кровеносных сосудов с использованием различных типов клеток. Эта методика позволит исследователям изучать разнообразные аспекты биологии сосудов на мышиных моделях. После выполнения данной процедуры можно также применить другие методы, такие как количественная ПЦР и вестерн-блоттинг, для получения ответов на дополнительные вопросы, например, об изменениях в экспрессии генов и протеомике.

Этот эффективный метод позволит исследователю изучить in-vivo взаимодействие эндотелиальных клеток и паразитов в процессе формирования кровеносных сосудов, что является ключевым этапом андогенеза. Данный метод также позволит изучать другие межклеточные взаимодействия, имеющие значение для понимания таких сосудистых заболеваний, как легочная гипертензия и другие.