Применение непроницаемых барьеров в сочетании с Factor кандидат замачивают шариков для изучения индуктивные сигналы в Chick

Целью данного хирургического вмешательства является выяснение механизмов индукции конечностей у куриного эмбриона путем предотвращения диффундации сигнальных молекул из медиальных тканей в клетки мезодермы латеральной пластины и изучения ее влияния на экспрессию генов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как, например, каковы индуктивные сигналы для контроля инициации зачатков конечностей. Преимущество данной методики заключается в том, что эмбрион цыпленка доступен для хирургических манипуляций и очень прочен, кроме того, неоперированная контралатеральная контрольная зачатка конечности служит очень полезным внутренним контролем.

Сьюзан Уайлд продемонстрирует процедуру. Для начала отрежьте квадратный кусок алюминиевой фольги толщиной 1 см толщиной 0,013 мм и простерилизуйте его, протерев 70% этанолом. Затем поместите квадрат на стерильную пластиковую чашку Петри диаметром 6 см.

Чтобы предотвратить статическое прилипание, откиньте крышку и сделайте новую для блюда из той же фольги. Затем установите чашку Петри на сценическую сетку под бинокулярным микроскопом с 1,6-кратным увеличением. С помощью небольшого скальпеля с лезвием No 15 отрежьте полоски фольги шириной 1,3 мм длиной 2 мм.

Отделите полоски фольги с помощью двух пар щипцов номер четыре. Затем сделайте изгиб под прямым углом в центре барьера из фольги так, чтобы он напоминал шарнир. Выровняйте барьеры в центре чашки Петри так, чтобы одна сторона была прижата к чашке, а другая направлена вверх из чашки, подготовьте 20 или более барьеров до дня работы.

Накройте блюдо крышкой из фольги и храните преграды в месте, где их никто не потревожит. Когда яйцо лежит на боку, крепко возьмитесь за пару сильных щипцов типа АА и контролируемым колющим движением проткните тупой конец яйца, содержащего воздушный мешок, удерживая яйцо свободной рукой. Убедитесь, что внутренняя мембрана оболочки была нарушена.

Далее возьмите яйцо в обе руки и поверните его на 180 градусов вдоль его горизонтальной оси. Затем возьмите кусок прозрачной ленты, площадью примерно 5 см квадратной, и плотно приклейте его к самой верхней поверхности яйца, чтобы скорлупа яйца не рассыпалась на эмбрион при открытии яйца. С помощью изогнутых ножниц аккуратно прорвитесь через скорлупу и связанные с ней внутренние клеточные мембраны в центре самой верхней части яйца.

Одним лезвием ножниц сделайте очень маленькое отверстие, чтобы воздух мог проникать в яйцеклетку над зародышем. С помощью ножниц увеличьте отверстие в скорлупе до круга диаметром примерно 1 см. Удалите этот кусок скорлупы размером с яйцо из яйца.

Закройте отверстие на яйце куском прозрачного скотча размером примерно 5 см квадрата. Прижмите ленту так, чтобы приклеить ее только по краю отверстия, оставив оставшуюся ленту свободной. Затем можно ухватиться за свободную ленту, чтобы легко распечатать яйцо.

Возьмите эмбрион 15-й стадии из инкубатора и поместите яйцо на подставку для яиц под бинокулярный микроскоп с увеличением 3,2x или выше. Затем снимите верхний слой прозрачного скотча. С помощью стального микроножа сделайте надрез через вителлиновую мембрану и боковой поместите прилегающую к сомитам мезодерму 26-32 с правой стороны эмбриона.

Возьмите барьер с помощью микрощипцов номер 5 на одном конце и скрутите барьер, чтобы ввести свободный конец в разрез. Как можно скорее запечатайте яйцо прозрачным скотчем и верните его в инкубатор. Если бусина должна быть вставлена вместе с барьером, во-первых, приготовьте пропитанные ретиноевой кислотой бусины, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Далее возьмите бусину и пару микрощипцов номер 5 и вставьте ее в разрезанную поверхность бокового места мезодермы на дистальной стороне разреза. Затем вставьте барьер в разрез проксимальнее бусины. Запечатайте яйцо и сразу же верните его в инкубатор.

Если бусина или бусины должны быть введены без барьера, не делайте длинный разрез. Вместо этого сделайте небольшой разрез через мембрану вителлина и в мезодерму боковой пластины в том месте, где должна быть размещена бусина. Затем возьмите бусину и микрощипцы под номером 5 и вставьте ее в отверстие в боковой пластине мезодермы.

Протолкните его немного дальше закрытыми концами щипцов. Возьмите из инкубатора эмбрион десятой стадии с окном и поместите яйцо на подставку для яиц под бинокулярным микроскопом с увеличением 3,2x или выше, если это предпочтительно. Затем с помощью стального микроножа сделайте надрез через вителлиновую мембрану и латеральную мезодерму пластины, латерально к примитивной полосе на каудальном конце эмбриона на одной линии с сомитами, длиной примерно шесть сомитов.

Далее подхватите барьер парой микрощипцов номер 5, на конце выступающих из чашки Петри и поверните рукой, чтобы ввести свободный конец барьера в разрез. Как можно скорее запечатайте яйцо прозрачным скотчем и верните его в инкубатор. Если бусина должна быть введена без барьера, сделайте небольшой разрез через вителлиновую мембрану и в мезодерму боковой пластины в том месте, где должна быть размещена бусина.

Затем возьмите бусину и пару микрощипцов No 5 и вставьте их в отверстие в боковой пластине мезодермы. Наконец, протолкните его немного дальше с помощью закрытых концов щипцов. Здесь показано барьерное положение на предполагаемом уровне ног сомитов 26-32 в эмбрионе 15 стадии.

Этот барьер приводит к тому, что экспрессия Fhf10 и Fhf8 отсутствует в области зачатка ноги на прооперированной стороне и присутствует на неоперированной левой стороне. Тем не менее, экспрессия Tbx4 наблюдается как на 19-й, так и на 23-й стадии на прооперированной стороне. Это означает, что одной экспрессии Tbx4 недостаточно для инициирования вырастания задних конечностей из lpm.

Когда пропитанные ретиноевой кислотой шарики помещаются дистальнее барьера на стадии 15, Tbx4, Fgf10 и Fgf8 экспрессируются на прооперированной стороне, так как они находятся на левой контрольной стороне. Таким образом, при нормальном развитии ретиноевая кислота из сомитов необходима до того, как может начаться рост почек конечностей. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать непроницаемые барьеры и потенциальные пропитанные факторные бусины для изучения того, как индуктивные сигналы регулируют инициацию зачатков конечностей у куриного эмбриона.