Пробирного CFSE основе для изучения миграции мышиной кожи дендритных клеток в Опорожнение лимфатических узлов во время инфекции с

Общая цель данного анализа с использованием флуоресцентных трекеров клеток заключается в мониторинге и характеристике специфических популяций интересующих клеток при их миграции из кожи в дренирующий лимфатический узел после инфекции стопы Bacille Calmette-Guerin (BCG). Мы использовали этот метод для идентификации популяции дендритных клеток, которые перемещаются в дренирующий лимфатический узел после инфекции кожи BCG. Данная методика позволила изучить миграцию клеток путем введения опухолей в определенное 24-часовое временное окно.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы инъекции в подушечку лапы и выделения лимфатического узла трудно освоить только по тексту. Для введения Mycobacterium bovis BCG, после подтверждения надлежащего уровня седации с помощью щипкового теста пальца, используйте шприц с иглой 29-го калибра длиной 1/2 дюйма, чтобы инокулировать в подушечку задней лапы мыши в возрасте от 8 до 12 недель 1×10⁶ колониеобразующих единиц бактерий в 30 µL PBS. В контрольные подушечки лап вводите только PBS.

Затем наблюдайте за животными до тех пор, пока они полностью не придут в сознание и не смогут опираться на инъецированную подушечку лапы. Для инъекции CFSE в соответствующий временной точке после введения BCG разбавьте во флаконе 5 мМ CFSE комнатной температуры в десять раз в PBS, тщательно ресуспендировав раствор. Затем наберите в шприц разбавленный CFSE и введите 20 мкл в ту же подушечку задней лапы, в которую была сделана первая инъекция.

Через 24 часа после инъекции CFSE аккуратно сделайте вертикальный разрез в области заднего бедра и удалите мышечный жир. Затем с помощью ножниц и пинцета обнажите и извлеките подколенный лимфатический узел, расположенный глубоко в жировой сумке в подколенной ямке. Перенесите лимфатический узел в 0,5 milliliters стерильного PBS на льду и гомогенизируйте его, пропустив через клеточный фильтр с порами 70 micron в одной лунке six well plate, содержащей пять milliliters PBS, используя поршень three milliliter syringe.

Промойте фильтр еще 5 миллилитрами буфера и перенесите суспензию клеток в пробирку объемом 15 миллилитров. Затем центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в достаточном объеме буфера. Для маркировки клеток для проточной цитометрии я перенесу от 1 до 10 × 10⁶ клеток в полистирольные пробирки с круглым дном объемом 5 миллилитров и промою клетки свежим буфером для FACS.

Ресуспендируйте осадки в 50–100 мкл соответствующего коктейля антител, содержащего анти-мышиные CD16 CD32 для блокирования неспецифических FC-опосредованных взаимодействий, в FACS-буфере на льду в защищенном от света месте. Через 30–45 минут промойте клетки FACS-буфером и ресуспендируйте осадки в 50–100 мкл свежего FACS-буфера. Основная часть мечения CFSE в подколенном лимфатическом узле наблюдается в клетках с высоким уровнем MHC-II и низким уровнем CD11c, что соответствует дендритным клеткам кожи, мигрирующим в дренирующие кожу лимфатические узлы.

Как частота, так и общее количество этих меченых клеток в подколенных лимфатических узлах мышей, инфицированных BCG, оказываются повышенными по сравнению с контрольной группой, которой вводили PBS; это позволяет предположить, что BCG усиливает перемещение этих клеток в дренирующий лимфатический узел. Дендритные клетки кожи продолжают поступать в дренирующие лимфатические узлы вплоть до пяти дней после инфицирования, что значительно продлевает миграцию дендритных клеток в данной модели по сравнению с временным интервалом первичной активации антигенспецифических CD4-положительных T-клеток в подколенном лимфатическом узле. Кроме того, мигрирующие дендритные клетки кожи экспрессируют повышенные уровни костимулирующих молекул, что подтверждает концепцию активации этих мигрирующих дендритных клеток.

Важно отметить, что как резистентные к лимфоузлам моноцитоподобные, так и плазмоцитоподобные дендритные клетки, которые попадают в воспаленные лимфатические узлы через высокоэндотелиальные венулы, а не через афферентные лимфатические сосуды, являются CFSE-отрицательными, что дополнительно подтверждает, что мечение CFSE происходит преимущественно в подушечке лапы. Кроме того, дополнительный анализ методом проточной цитометрии показывает, что субпопуляция клеток с низким уровнем EpCAM и высоким уровнем CD11b является основным мигрирующим подмножеством дендритных клеток кожи, которые дренируются в подколенный лимфатический узел в ответ на инфекцию BCG. После освоения эта техника может быть выполнена за пять минут при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении этой процедуры важно соблюдать осторожность при выборе места инъекции и объема вводимого вещества; следует проявлять особую осторожность, чтобы не повредить дренирующий лимфатический узел во время диссекции. После завершения процедуры для дальнейшего анализа микроэкспрессии специфических подмножеств клеток можно использовать другие методы, такие как проточная цитометрия или конфокальная микроскопия. Данный метод позволил исследователям отслеживать перемещение клеток из кожи в дренирующий лимфатический узел в течение 24 часов в ответ на инфекцию или вакцинацию.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как выполнять инъекции в подушечку лапы, а также как находить и изолировать дренирующие лимфатические узлы для отслеживания и характеристики интересующих вас популяций мигрирующих дендритных клеток.