Наводить Complete полипа Регенерация от спинных Physa из Starlet актинии Nematostella vectensis

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы проиллюстрировать предсказуемую серию морфологических изменений, которые произошли во время регенерации полного полипа из крошечного участка ткани, удаленного из аборальной верхушки Nematostella vectensis. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биологии регенерации, например, как клетки в месте раны реорганизуются и развертываются для воссоздания отсутствующих структур. Идея этого метода пришла мне в голову, потому что я хотел увидеть, как относительно сложный полип может собраться обратно, начиная с наименьшего количества морфологической информации. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что прогрессирование стадии после первоначального ранения иногда скрыто слизистой оболочкой.

Как правило, новичкам в этом методе будет трудно добиться полного отделения ткани в месте раны из-за мягкой, липкой, студенистой природы полипа. Начните эту процедуру с кондиционирования nematostella vectensis, как описано в текстовом протоколе. При использовании этого метода особенно важно, чтобы выбранные животные были одинакового размера и имели одинаковую культурную историю, например, идентичное кормление и другие параметры состояния.

Уберите миску с отобранными животными из инкубатора в комнатный свет не менее чем за час до ампутации. С помощью пластиковой пипетки с широким отверстием перенесите пятерых животных из бассейна, которые будут ампутированы, на дно стерильной стеклянной режущей миски диаметром 100 миллиметров, содержащей искусственную морскую воду с соленостью 12 частей на тысячу. Поместите чашку на предметный столик стереомикроскопа с переменным увеличением от 10 до 40x.

Выберите полипы примерно одинаковой длины и поместите их в отделенную от колонии миску за три дня до ампутации. С помощью стерильного скальпеля ампутируйте аборальную физу из каждого полипа, чтобы получить участок физы, длина которого примерно равна его ширине и не содержит брыжейки. Чтобы добиться этого, поместите лезвие скальпеля в контакт с животным в нужном месте ампутации.

Делайте это либо без посторонней помощи, либо осторожно захватывая тело животного с помощью щипцов номер пять. Разрежьте ткань, используя изогнутое лезвие скальпеля покачивающими движениями по всему телу. Удалите каждый ампутированный донорский полип из чашки и верните его в отдельную миску с надписью «Объединенные ампутанты».

После датировки чаши, верните ее в стоковую культуру. Вырезанные физы, оставшиеся в разделочной чаше, промойте в искусственной морской воде с соленостью 12 частей на 1 000. Затем перенесите каждую физу в отдельную стерильную лунку в многолуночной клеточной культуральной тарелке, которая содержит 10 миллилитров искусственной морской воды с соленостью 12 частей на 1000 в каждой лунке.

Повторите эти шаги, чтобы собрать не менее пяти physa в каждую лунку, чтобы зарезервировать их для каждой экспериментальной обработки. Поместите планшет с physa в инкубатор с регулируемой температурой при фиксированной температуре, определяемой желаемой скоростью регенерации. Измерьте физу с помощью стереосоставного микроскопа с переменным увеличением.

Оцените свежесрезанную nematostella physa как нулевую стадию и продолжайте подсчет в то же время каждый день после ампутации, или DPA, используя NRSS. Оценивайте physa как нулевую стадию, если свежесрезанная physa выглядит как чашеобразная масса, напоминающая рыхлый баллон, с открытым участком раны, который, вероятно, виден. Оцените physa как первую стадию, если рана ампутации кажется закрытой.

Оценивайте physa как вторую стадию, если поверхность слухового полюса кажется раздутой, обнажая восемь приподнятых арок, расположенных в радиально-симметричном узоре и разделенных бороздками. На втором этапе наблюдайте небольшие полусферические пузырьки на вершине дуг, которые примерно равны по высоте и ширине, вероятно, переходные и изначально состоят из одного слоя эктодермальных клеток. По мере старения тела он может обхватываться слизистой оболочкой, которую следует осторожно удалить щипцами.

Оценивайте физу как третью стадию, если зачатки щупалец, содержащих слои эндодермальной и эктодермальной ткани, стабильно формируются на слуховом конце хотя бы некоторых радиальных дуг. Оценивайте physa как четвертую стадию, если physa содержит восемь отчетливых видимых брыжеек, которые простираются в кишечнике от вставок в стенке тела с длиной слуховых аборальностей, которая более чем в два раза превышает их радиальную ширину, измеренную от места, где они соединяются с глоткой на ее аборальном конце или энтеростом. Наконец, оценивайте физу как пятую стадию, если физа имеет более четырех брыжеек со складками, и плиссировка более полная и извилистая, чем на четвертой стадии.

На пятой стадии животное имеет почти нормальный взрослый вид, но видимых гонадных клеток нет. Эта группа контрольной группы nematostella physa, получавших 0,1% ДМСО, полностью регенерировала до пятой стадии. Physa, обработанная хлорохином, однако, не смогла полностью сформировать завершенные брыжейки.

Крупный план показывает как наличие, так и отсутствие складок в брыжейках у физы, которая была инкубирована в хлорохине. Этот график иллюстрирует совокупные результаты лечения хлорохином. Любое лечение от 10 до 50 микромоляров вызывало подобные дефекты, в основном отсутствие полного реформирования брыжеек в том смысле, что брыжейки не имели складок.

После освоения этой техники она может быть выполнена менее чем за час для каждой шестилуночной пластины, содержащей 30 вырезанных физ. Подсчет очков происходит быстро, возможно, требуется полчаса на каждую реплику. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как ампутировать физу, чтобы визуализировать морфологические изменения, происходящие при регенерации полного полипа из крошечного участка аборальной ткани.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает морфологические стадии, на которых можно зафиксировать молекулярные события, лежащие в основе регенерации полного полипа из чашки визуально однородной ткани. При проведении этой процедуры важно помнить о предварительной подготовке животных с учетом истории питания, о разделении пополам, чтобы исключить взрослую брыжейку, и о стандартизации размера регенерирующей физы, чтобы уменьшить вариации в рамках лечения. После этой процедуры можно было бы оценить, например, эффекты генетических мутаций или возмущений сигнальных путей с малыми молекулами.

Или морфогенетические изменения могут быть коррелированы с микроскопическим анализом самопролиферации, прослеживанием линии или экспрессией гена второго сайта. Этот метод проложит путь исследователям в области биологии регенерации к изучению клеточной биологии, сигнальных путей и морфогенетических процессов, которые лежат в основе замечательной регенеративной способности этого модельного организма.