Измерение Жесткость Ex Vivo Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы описать процедуры использования атомно-силовой микроскопии для измерения модуля упругости Ex Vivo аорты мышей. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы в области сосудистой биомеханики и заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания и старение. Основным преимуществом этой методики является то, что АСМ характеризует биомеханические свойства мягких биологических образцов, таких как артерии и клетки, с высокой степенью точности на уровнях Даномасштаба.

Я представлю процедуры АСМ, а доктор Шу-лин Лю, научный сотрудник нашей лаборатории, покажет, как изолировать аорту мышей. Для начала усыпьте мышь и рассеките ее до аорты, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. С помощью пары небольших щипцов захватите жир вокруг аорты и с помощью небольших ножниц аккуратно отрежьте жир, который находится вокруг аорты.

Далее аккуратно захватите аорту щипцами и сделайте один разрез через сосуд в начале восходящей аорты, а другой разрез в конце нисходящей аорты, чуть выше брюшной аорты. Перенесите рассеченную аорту в 60-миллиметровую посуду, содержащую PBS без кальция или магния. В чашке продолжайте рассекать остатки жировой ткани из аорты, а затем откройте аорту в продольном направлении.

Затем отрежьте кусок размером 2 на 4 миллиметра от нисходящей аорты и кусок такого же размера от дуги аорты для анализа с помощью атомно-силового микроскопа. Поместите эти кусочки ткани в свежую 60-миллиметровую пластиковую посуду и держите их влажными в капле PBS. Осторожно удалите PBS вокруг ткани с помощью лабораторной салфетки, не касаясь аорты.

Убедитесь, что просветная сторона ткани обращена вверх, и используйте от пяти до 10 микролитров цианоакрилатного клея, чтобы аккуратно приклеить каждый конец открытой аорты к пластине. Очень важно, чтобы аорта не растягивалась во время этого процесса. Когда закончите, убедитесь, что склеенная аорта не загнута и не плавает.

После высыхания клея на воздухе на аорте в течение 30-60 секунд аккуратно добавьте PBS и погрузите образец. С помощью пинцета наденьте на держатель щупа зонд АСМ на основе силиконовой селитры со сферическим наконечником. Затем надежно закрепите держатель щупа на креплении ZScanner головки AFM.

Далее откройте программное обеспечение AFM. Выберите тип эксперимента, перейдя в категорию «Эксперимент» и выбрав «Контактный режим». Затем перейдите в раздел «Экспериментальная группа» и выберите «Контактный режим» в Fluid, и, наконец, перейдите в раздел «Эксперимент» и выберите «Контактный режим» в Fluid.

Выбрав их, нажмите «Загрузить эксперимент». Это включит лазер. Затем подготовьте образец, используемый для юстировки лазера, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Поместите образец на АСМ. Расположите лазерное пятно на кончике зонда АСМ, отрегулировав ручки позиционирования лазера. Затем с помощью ручек позиционирования детектора отрегулируйте положение фотодиода до тех пор, пока значения вертикального отклонения не окажутся в диапазоне от нуля до отрицательного одного вольта, а горизонтального отклонения не приблизятся к нулю вольт.

Затем убедитесь, что сигнал суммы лазера максимизирован. При необходимости отрегулируйте положение лазерного луча на наконечнике АСМ, а также положение фотодиода, чтобы получить сигнал максимальной суммы. Чтобы начать калибровку, выберите параметры проверки и установите параметр для параметра Размер сканирования равным нулю.

Установите Скорость сканирования (Scan Rate) на один герц. Установите Sample/Line (Sample/Line) на 256, а заданное значение Deflection (Отклонение) на 20 нанометров. Затем выберите «Вовлечь».

Как только щуп соприкоснется с поверхностью пластины, нажмите на кнопку Рампа. Затем выберите расширенный режим в меню панели инструментов сканирования и установите параметры, как показано здесь. На панели инструментов пандуса выберите непрерывность пандуса и получите силовую кривую на пластине.

В этой силовой кривой установите Channel 1 в положение Deflection Error, чтобы программное обеспечение могло отображать результаты в виде вертикального отклонения в зависимости от Z-положения. Щелкните левым или правым концом на кривой силы и перетащите курсор, чтобы охватить линейную область кривой силы, которая будет подогнана к прямой линии. Затем выберите Ramp на панели инструментов и нажмите Update Sensitivity.

Запишите текущее значение. Далее выберите «Калибровать» и нажмите на «Детектор». Входное и среднее значение из пяти измерений в поле Чувствительность к отклонению.

Нажмите кнопку «Снять» два-три раза, чтобы поднять головку АСМ и предотвратить взаимодействие между наконечником АСМ и пластиной во время процесса тепловой настройки. Затем нажмите «Thermal Tune» на панели инструментов. Установите диапазон тепловой настройки в диапазоне от одного до 100 килогерц, а поправку на чувствительность к отклонению установите на 1,144 для V-образных консолей и 1,166 для прямоугольных консолей.

В меню «Термонастройка» нажмите «Получить данные», чтобы получить кривую термонастройки. Затем разместите красную черточку на линиях по обе стороны кривой и выберите модель лоренцианского или простого гармонического осциллятора в зависимости от того, какая из них лучше соответствует данным. Затем нажмите «Посадочные данные» и выберите «Рассчитать пружину K», чтобы сохранить это значение.

Поместите 60-миллиметровую культуральную чашку, содержащую ткань аорты, на предметный столик микроскопа и закрепите пластину держателем магнитной пластины. Как только аорта войдет в контакт с консолью, убедитесь, что пьезоцентр устойчив, и нажмите «Рампа». Установите для параметра Размер шкалы значение три микрометра, для параметра Режим запуска — значение Относительный, а для параметра Порог запуска — значение 100 нанометров.

Затем выберите непрерывный пандус. Обратите внимание, что точка соприкосновения между зондом и образцом находится примерно в центре и в нижних трех четвертях цикла нарастания Z. Если этого не наблюдается, отсоединитесь от образца, при необходимости отрегулируйте размер пандуса и снова зацепите образец.

Затем нажмите на «Микроскоп» в строке меню и выберите «Включить настройки». Измените вывод SPM на 30 микрометров, затем нажмите OK. Изучив кривую силы, нажмите «Захват» в строке меню и выберите «Захват имени файла». Введите желаемое имя файла, заканчивающееся на OOO, выберите нужную папку и сохраните данные.

Чтобы начать анализ, откройте программное обеспечение для анализа кривых силы, загрузите файл, который необходимо проанализировать, а затем измените и сгладьте данные, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Затем выберите «Коррекция базовой линии» в строке меню и установите входные параметры, как показано ниже. Затем настройте вертикальную пунктирную синюю линию на графике, чтобы она охватывала плоскую часть силовой кривой, и нажмите кнопку «Выполнить».

Затем нажмите Отступ в меню панели инструментов и установите входные данные, как показано ниже. Сохраните эти значения и проанализируйте модуль Юнга для каждой из областей интереса, измерив пять силовых кривых на каждую область, которые взяты на небольшом расстоянии друг от друга. Чтобы определить общую жесткость образца ткани, необходимо провести до 25 измерений в пяти различных областях участка образца в ткани.

Эти области можно использовать для сравнения тканей в разных местах, таких как дуга аорты и нисходящая аорта. На этих графиках показаны репрезентативные силовые кривые нисходящей аорты и дуги аорты на примере одной и той же аорты мыши. На основе этих данных модуль упругости может быть рассчитан для каждой группы и использоваться для сравнения между различными регионами или условиями.

После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как правильно изолировать аорту мыши и измерить модуль упругости с помощью атомно-силовой микроскопии. После попытки выполнить эту процедуру важно не забыть выполнить измерение АСМ сразу после выделения тканей. После освоения изоляция аорты может быть завершена примерно за 45 минут на мыши, а измерение и анализ АСМ могут быть завершены за полтора часа, если они выполнены правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммунофлуоресцентный или пролиферативный анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с ремоделированием сосудов или пролиферацией гладкомышечных клеток сосудов.